臨床ELISA測定現通常為采用手工操作的以微孔板條為固相的測定模式，測定操作非常簡單，一般涉及到標本的收集保存、試劑準備、加樣、溫育、洗板、顯色、比色、結果判斷和結果報告及解釋等方面，其中任一步驟的不當都會影響測定結果，且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。現分述如下。
一.臨床標本的收集和保存
用于ELISA測定的臨床標本最為常用的是血清（漿），有時因為特定的檢測目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標本。目前臨床上使用血清標本測定的標志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物、激素、特種蛋白、細胞因子和治療藥物等。對用于激素和治療藥物測定的血清標本的收集，要注意收集時間甚或體位有可能會對測定結果產生影響。如可的松在早晨4～6點之間，會有一峰值出現：生長激素、促黃體激素（LH）和促卵泡激素（FSH）均以陣發性方式釋放，因此，在測定此類激素時，有必要在密切相連的時間間隔內采取數份血樣本，以其中間值為測定值。又如當從臥位變為站立位時，血清中腎素活性將出現明顯增高。再如治療藥物的檢測，應根據藥代動力學選擇服藥后的最適時間抽血檢測。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標志物和特種蛋白等的檢測的血清標本的收集則沒有時間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個方面：
（1）要注意避免出現嚴重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標記酶的ELISA測定中，如血清標本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應顯色。
（2）樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細菌污染，一則細菌的生長，其所分泌的一些酶可能會對抗原抗體等蛋白產生分解作用；二則一些細菌的內源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會對用相應酶作標記的測定方法產生非特異性干擾。
（3）血清標本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長時間保存，應在-70℃以下。
（4）冰凍保存的血清標本須注意避免因停電等造成的反復凍融。標本的反復凍融所產生的機械剪切力將對標本中的蛋白等分子產生破壞作用，從而引起假陰性結果。此外，凍融標本的混勻亦應注意，不要進行劇烈振蕩，反復顛倒混勻即可。
（5）標本在保存中如出現細菌污染所致的混濁或絮狀物時，應離心沉淀后取上清檢測。
二、試劑準備
在臨床實驗室，對試劑準備一般不太注意，通常的做法是，在實驗時將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時間不夠的問題，其直接的后果是對一些弱陽性標本的檢測出現假陰性。因此在ELISA測定中試劑的準備最為關鍵的是，在實驗開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置20分鐘以上后，再進行測定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應步驟中，能使反應微孔內的溫度能較快地達到所要求的高度，以滿足測定要求。其次，目前的商品ELISA試劑盒中的洗板液均需在實驗室使用時對所提供的濃縮液稀釋配制，因此稀釋時所用的蒸餾水或去離子水應保證質量。此外，當試劑盒以OPD為底物時，則底物溶液應在反應顯色前臨時配制。
三、加血清樣本及反應試劑
在現在的ELISA商品試劑盒中，血清樣本的加入幾乎是唯一的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。
四、溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。
溫育這一步是臨床ELISA測定中最容易出現問題的步驟。通常目前國內ELISA商品試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鐘～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時才能有較完全的結合，低于1小時，可能會影響測定下限。因此，關于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：
（1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本和/或反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題，就是在每一年的冬季總有那么一個多月的時間，在做HBsAg測定的室內質控中，測定由衛生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原因為何？這可能就與南方冬天室內溫度較低有關，此時微孔板轉入溫箱后37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。
（2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時，另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間最為完全。如2～8℃下反應24小時。較高的反應溫度，由于分子運動的加憐惜，反應時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。
（3）“邊緣效應”的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應”，即外周孔顯色較中心孔深，產生這種“邊緣效應”的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學特征的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應”，并且可提高測定的重復性。
總而言之，在臨床ELISA測定中，要保證好的測定效果，可采用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或將浸透水的沙布放入一大飯盒中成一濕盒，放于溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內的高溫度，而使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。
五、洗板
固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。因此，洗板對于ELISA測定來說，也是極其關鍵的一步。以HRP作為標記酶的ELISA試劑盒中使用的洗板液一般為含0.05%Tween20的中性PBS，Tween20為一種非離子去垢劑，既含親水基團，也含疏水基團，其在洗滌中的作用機理是，借助其疏水基團與經疏水性相互作用被動吸附于聚苯乙烯固相上蛋白的疏水基團形成疏水鍵，從而削弱蛋白與固相的吸附，同時在其親水基團與液相中水分子的結合作用下，促使蛋白質脫離固相而進入液相，這樣就可達到去掉非特異吸附物的目的，但由于抗體或抗原的包被通常也是通過在堿性條件下與固相的疏水性相互作用而被動吸附于固相，因此要注意非離子去垢劑的使用濃度，洗板液中Tween20濃度高于0.2%，可使包被于固相上的抗原或抗體解吸附而影響試驗的測定下限。
在臨床實驗室中，ELISA測定的洗板一般有兩種方式，即手工和洗板機洗板。手工洗板即是在每次反應溫育后，將反應液吸出或甩干，然后在板孔中加滿洗液，放置2～3分鐘后，將洗液吸出或甩干，再在吸水紙上拍干。重復上述洗滌步驟3～4次，最后在吸水紙上拍干，即可進行下一步測定操作。洗板機洗板則是將上述手工操作改由洗板機進行，使用洗板機洗板的一個特點是，每次洗板后不能拍干，故有較多的液體殘留，液體殘留量小的洗板機洗板至徹底所需的次數要少于殘留量大的洗板機。在特定臨床實驗室所使用的洗板機，到底洗多少次能達到要求，可進行下面這個簡單的實驗：選擇4×8 HBsAgELISA包被板條，每2×8孔分別加入相同一份弱陽性和一份陰性樣本，按試劑盒說明加入酶結合物并完成溫育后，洗板孔時按第一排4孔洗1次、第二批4孔洗2次、第3排4孔洗3次——直至第8排4孔洗8次，加底物顯色測定，如洗3次后，顯色不再改變，即洗3次的板孔比色測定與4次、5次洗板的板孔的吸光度等相同，陽性/陰性值保持最大不變，則可以認定該實驗室所用洗板機3次洗板即可達到要求。
六、顯色
在目前的以HRP作為標記酶的商品ELISA試劑盒中，如以TMB為底物，則提供的底物為A和B兩瓶應用液；如以OPD為底物，則試劑盒提供OPD片劑或粉劑，臨用前配制。一般商品試劑盒顯色反應條件為37℃或室溫反應15～30分鐘。從理論上說，37℃30分鐘才可以使HRP的底物催化反應完全，盡管在最初的10分鐘內，絕大部份催化反應即可完成。因此，為使弱陽性樣本孔能有充分的顯色，建議在37℃下反應25～30分鐘后，終止反應比色測定。
此外，在加入底物開始顯色反應前，最好是先檢查一下底物溶液的有效性，即可將A和B兩種液各加一滴于清潔的空板孔或eppendorf管中，觀察是否有顯色出現，如有，則說明底物已變質。以OPD為底物，配好后應為無色，否則就不能使用。以TMB為底物，整個顯色反應過程無需避光，而以OPD為底物，則需避光進行。關于TMB和OPD的顯色反應特點及注意點可參考前面有關章節內容。顯色反應完成后，加入酸終止反應，振蕩混勻后即可進行下面的比色測定或肉眼判斷結果。
七、比色
ELISA的比色測定由酶標儀進行，有的同行可能會認為，既然由酶標儀進行，那么此時便可以萬事大吉了，其實不然，因為當代較為先進的酶標儀器儀表，均有較多的功能，使用不當，會得到令人難以理解的結果。如使用酶標儀比色測定后，有許多陰性測定孔的吸光度值為負數或測定假陽性率大大增加等等。這主要是沒有正確地理解和使用酶標儀所致。至于如何正確理解和使用酶標儀詳見后面有關章節。此處，只是強調下面兩點：
（1）比色測定時，一定要注意酶標儀的波長是否已調至合適或所用濾光片是否正確。由于有的臨床實驗室在進行ELISA測定時，以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據要求隨時更換。因此，容易出現濾光片錯用的問題。
（2）單波長或雙波長比色選擇的問題。中檔以上的酶標儀基本上都同時具有單波長和雙波長比色功能。所謂的單波長比色即是通常的以對顯色具有最大吸收的波長如450nm或492nm進行比色測定；而雙波長雙色則酶標儀在敏感波長如450nm和非敏感波長如630nm下各測定一次，敏感波上下的吸光度測定值為樣本測定酶反應特異顯色的吸光度與板孔上指紋、刮痕、灰塵等臟物所致的吸光度之和；非敏感波長下測定即改變波長至一定值，使得樣本測定酶反應特異顯色的吸光度值為零，此時測得的吸光度即為臟物的吸光度值。最后酶標儀給出的數值為敏感波長下的吸光度值與非常感波長下的吸光度值的差。因此，雙波長比色測定具有能排除由微滴板本身、板孔內標本的非特異吸收、指紋、刮痕、灰塵等對特異顯色測定吸光度的影響的優點，一般不必設空白孔。如在使用雙波長比色時，仍設空白孔，就可能會造成前面提到的測定孔吸光度為負數的現象。由于ELISA測定中單個空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性，也就是說每次測定或同次測定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測定值，故而在ELISA測定比色時，最好是使用雙波長比色。
八、結果判定
臨床ELISA測定按其表示測定結果的方式分為定性和定量測定兩大類。定性測定只是對標本中是否含有待測抗原或抗體作出“有”或“無”的結論，分別用“陽性”和“陰性”來表示。可見定性測定通常是用于傳染性病原體的抗原或抗體的測定，以判斷特定病原體感染的存在與否。而定量測定則是對標本中待測抗原的多少進行量值測定，以具體數值表示。定量測定基本上是用于非病原體抗原物質的測定，如激素、細胞因子、腫瘤標志物、小分子藥物等。目前國內在臨床上應用的ELISA試劑盒絕大部份是用于傳染性病原體的抗原或抗體的定性測定，也有少部份用于αFP、hCG、細胞因子等的定量測定。ELISA定性測定的“陽性”和“陽性”的判定依據是試劑盒所確定的陽性判定值（Cut-off）。定量測定的“量值”依據是試劑盒中所帶標準品同時測定得出的劑量反應曲線（又稱標準曲線）。有關ELISA定性和定量測定結果的數據處理后面將有專門章節討論。本處只想強調的一點是，ELISA定性測定的“陰性”和“陽性”結果的判定依據只能是試劑盒本身所確定的Cut-off值，而不能以衛生部臨床檢驗中心供應弱陽性定值質控血清。為什么要強調這一點呢？主要是因為以前有很多基層實驗室均使用部中心供應的弱陽性定值質控血清（以前也稱“臨界值”血清）的測定吸光度來判定結果，高于其判為陽性，反之為陰性，而不管試劑盒Cut-off值為何。到目前為止，仍有一些實驗室在堅持這種錯誤的做法。試劑盒的Cut-off值的設立是建立在一系列科學試驗及統計學研究的基礎上的（詳見后述），而部中心供應的弱陽性定值質控血清主要是供臨床實驗室進行室內質控時使用。
下面再解釋一下在ELISA定性測定結果判定中常用的一些縮寫。
（1）S/CO：其中S為Sample(樣本)或Specimen(標本)的簡寫，表示的是標本測定的吸光度值，CO為Cut-off值的簡寫。除競爭抑制法外，其它ELISA定性測定模式中，當S/CO值大于或等于1時，標本的測定為陽性，小于1時為陰性。
（2）S/N或P/N：其中S同（1），N為Negative(陰性對照)的簡寫，P為Patient（患者）的簡寫。較早的試劑盒很多都使用S/N或P/N≥2.1為陽性判定標準，現仍有一些試劑盒使用這種方式。這種方式與S/CO方式無根本性區別，只不過是前者將陰性對照（N）的2.1倍視為Cut-off值而已。
九、結果報告及解釋
臨床ELISA測定結果的報告較為簡單。定性測定報陰性或陽性即可；定量測定則報出具體的數值。結果解釋比較起來要復雜的多，它要求實驗室技術人員對所測定的項目有較為全面的知識基礎。例如，對乙肝“兩對半”結果的解釋，不但要求檢驗者要知道不同的結果模式的臨床意義，而且必須對乙肝病毒的分子生物學、分子的變異及其對表型的影響有更深層次的了解。現在，檢驗不再是單純的實驗室測定，而已成為一門臨床醫學學科，即檢驗醫學，這就要求從事醫學檢驗工作的檢驗醫師，對所做的測定項目除了知其然，還要知其所以然，否則就難免為時代所淘汰。
綜上所述，盡管ELISA測定的操作步驟非常簡單，但有可能會影響測定結果的因素卻較多，分布在測定操作的各步之中，尤以加樣、溫育和洗板為甚。為幫助大家分析查找測定中出現問題的可能原因，特對常見問題及原因歸納總結于下表。
臨床ELISA測定中可能會出現的問題及可能的原因
問 題
可能的原因（非試劑盒本身的原因）
1．弱陽性質控樣本檢測不出
溫育的時間或溫度不夠；顯色反應時間太短；所用配制緩沖液的蒸餾水有問題
2．測定的重復性差
（相同樣本兩次測定結果不一致）
這是典型的由測定操作引起的問題，包括
（1）加樣本及試劑量不準；孔間不一致；
（2）加樣過快，孔間發生污染；
（3）加錯樣本；
（4）加樣本及試劑時，加在孔壁上部非包被區；
（5）不同批號試劑盒中組分混用；
（6）溫育時間、洗板、顯色時間不一致；
（7）孔內污染雜物；
（8）酶標儀濾光片不正確；
（9）血清標本未完全凝固即加入，反應孔內出現纖維蛋白凝固或殘留血細胞，易出現假陽性反應等。
3．白板
（陽性對照不顯色）
（1）漏加酶結合物；
（2）洗板液配制中出現問題，如量筒不干凈，含酶抑制物（如疊氮鈉）等。
（3）漏加顯色劑A或B；
（4）終止劑當顯色劑使用。
4．全部板孔均有顯色
（1）洗板不干凈；
（2）顯色液變質；
（3）加底物的吸光受酶污染；
（4）洗板液受酶等污染。
