分子生物學(xué)

提供分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)服務(wù)：核酸提取、載體構(gòu)建、蛋白表達(dá)與純化、CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除細(xì)胞系和動(dòng)物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等服務(wù)

CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因敲除細(xì)胞系篩選和建立

康朗生物可以通過自身T細(xì)胞和B細(xì)胞介導(dǎo)的免疫系統(tǒng)抵抗外源微生物的入侵和增殖，而低等的原核生物也有自己的應(yīng)對(duì)策略完成自我保護(hù)。CRISPR/Cas9系統(tǒng)就是其中一項(xiàng)重要的武器，是細(xì)菌為應(yīng)對(duì)病毒和質(zhì)粒攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機(jī)制。CRISPR/Cas9系統(tǒng)中crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對(duì)與tracrRNA（trans-activating RNA）結(jié)合形成雙鏈RNA。此tracrRNA/crRNA復(fù)合體作為引導(dǎo)員引導(dǎo)Cas9蛋白在crRNA引導(dǎo)序列靶定位點(diǎn)切斷雙鏈DNA。進(jìn)一步通過細(xì)胞內(nèi)同源重組等修復(fù)機(jī)制在切割位點(diǎn)缺失或插入不定長度的堿基序列，使得后續(xù)的細(xì)胞產(chǎn)生移碼突變，最終導(dǎo)致蛋白質(zhì)活性的喪失。

在針對(duì)細(xì)胞的基因組編輯過程中，我們通常將tracrRNA和crRNA融合成為1條sgRNA克隆至表達(dá)載體上，同樣可以起到靶向剪切的作用。通過對(duì)Cas9核酸酶進(jìn)行改造，使其可對(duì)任何物種的基因組進(jìn)行高效定向的編輯，可有效避免脫靶效應(yīng)。

服務(wù)內(nèi)容

1. 敲除基因序列分析，并設(shè)計(jì)針對(duì)該序列的3-5條sgRNA

2. 將sgRNA與表達(dá)載體連接，篩選陽性sgRNA克隆；

3. sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，流式分選GFP陽性細(xì)胞，篩選高效sgRNA；

4. 將sgRNA和Cas9質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，并篩選鑒定基因敲除細(xì)胞系敲除細(xì)胞株；

5. 基因敲除細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，并通過熒光定量PCR和Western Blotting檢測(cè)基因敲除情況；

6. 細(xì)胞株傳代培養(yǎng)，并進(jìn)行PCR二次鑒定。

實(shí)驗(yàn)收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)和周期

說明：關(guān)于基因敲除細(xì)胞系的篩選原則上進(jìn)行一次轉(zhuǎn)染和流式篩選，公司確保篩選到單等位基因敲除細(xì)胞系。若未獲得雙等位基因敲除細(xì)胞系則再進(jìn)行一次轉(zhuǎn)染和篩選。如果仍未獲得等位基因敲除細(xì)胞系則終止實(shí)驗(yàn)，公司提供單等位基因敲除細(xì)胞系。

客戶須知

1. 請(qǐng)?zhí)峁┐贸募?xì)胞系和培養(yǎng)條件；

2. 請(qǐng)?zhí)峁┐贸蛐畔ⅲɑ蛎Q，物種，NCBI號(hào)等）；

3. 如有特殊要求（特定位點(diǎn)敲除等）請(qǐng)?zhí)崆罢f明；

公司交付產(chǎn)物

1. 基因敲除細(xì)胞系兩管，每管細(xì)胞數(shù)目>1*106；

2. 敲除細(xì)胞系基因型鑒定結(jié)果；

3. 敲除細(xì)胞系熒光定量PCR和WB鑒定結(jié)果；

4. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

基因擴(kuò)增，載體構(gòu)建和蛋白表達(dá)純化

實(shí)驗(yàn)原理

利用基因工程的基本原理和方法，將DNA或cDNA片段與載體連接，獲得能夠表達(dá)目的基因的載體。我們可以在目的基因上添加小分子量標(biāo)簽（FLAG，HA，myc等）方便后續(xù)表達(dá)檢測(cè)。也能夠加入熒光標(biāo)簽（GFP, RFP, CFP,BFP, YFP等）直觀的觀察蛋白表達(dá)情況。我們獨(dú)特的多順反子表達(dá)載體，可以同時(shí)表達(dá)多個(gè)蛋白，為研究蛋白相互作用或者多亞基蛋白共表達(dá)提供了極大的便利。根據(jù)客戶的需要，我們還可以對(duì)載體進(jìn)行改造，滿足不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵蟆Ｔ谶M(jìn)行基因功能學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)，通常要對(duì)基因的某些位點(diǎn)進(jìn)行突變。我們通常使用高保真Pfu酶，利用重疊延伸PCR或者定點(diǎn)突變?cè)噭┖械姆椒ㄔ谀康幕蛑幸雴蝹€(gè)或多個(gè)堿基的突變，包括堿基的添加，刪除，替換等，從而對(duì)改變的目的蛋白進(jìn)行性狀和表型的研究。對(duì)于未知基因的序列，Rapid-amplification of cDNA ends（RACE）方法可以滿足大家的要求。這是一種基于一段已知的cDNA片段，通過向兩端延伸擴(kuò)增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。本公司有多年RACE擴(kuò)增經(jīng)驗(yàn)和優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，能夠有效擴(kuò)增大片段的未知序列。

服務(wù)內(nèi)容

1．通過對(duì)序列進(jìn)行分析，設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增目的片段；

2．通過酶切連接或In-Fusion等方法，將目的片段克隆至表達(dá)載體上；

3．原核表達(dá)蛋白可通過IPTG等進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳檢測(cè)，Western Blotting檢測(cè)；

4．將真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，直接熒光觀察或Western Blotting檢測(cè)，驗(yàn)證蛋白表達(dá)；

5．原核表達(dá)蛋白的大量表達(dá)和純化；

6．真核表達(dá)蛋白體內(nèi)和體外功能研究（詳見細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)部分）；

7. 基因編碼區(qū)，非編碼區(qū)的單位點(diǎn)，大片段基因，高GC含量和重復(fù)序列基因的單位點(diǎn)和多位點(diǎn)突變；

8. 未知基因3’和5’RACE特異性引物的設(shè)計(jì)和3’和5’端片段的擴(kuò)增；

載體構(gòu)建基本流程

載體構(gòu)建收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

注：基因組DNA或cDNA＞1ug；質(zhì)粒＞100 ng；PCR產(chǎn)物＞100ug；

蛋白表達(dá)純化基本流程

蛋白表達(dá)和純化收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)

基因定點(diǎn)突變基本流程

公司交付

1.含質(zhì)粒的甘油菌和質(zhì)粒（>5微克）

2. 測(cè)序結(jié)果和堿基序列圖

3 表達(dá)純化的蛋白和電泳圖

4. Western blotting檢測(cè)結(jié)果

5. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告

熒光定量PCR

實(shí)驗(yàn)原理

在進(jìn)行基因功能研究時(shí)，我們通常會(huì)通過觀察靶基因的表達(dá)量變化來判斷目的基因或藥物等對(duì)細(xì)胞的影響。靶基因的表達(dá)量變化可以通過在mRNA和蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。蛋白水平通常使用Western Blotting方法進(jìn)行（詳見WB檢測(cè)服務(wù)目錄），而在mRNA水平有多種方法進(jìn)行檢測(cè)，比如反轉(zhuǎn)錄PCR，Northern Blotting和熒光定量PCR（RT-qPCR）等。熒光定量PCR方法由于其可以準(zhǔn)確快速的對(duì)多個(gè)基因進(jìn)行精確定量而得到廣泛的應(yīng)用。該方法是一種基于普通PCR的改進(jìn)方法，在PCR擴(kuò)增的過程中利用具有DNA親和性的熒光染料或熒光標(biāo)記的核苷酸探針，每個(gè)循環(huán)收集一次熒光強(qiáng)度信號(hào)。通過熒光強(qiáng)度的強(qiáng)弱反應(yīng)擴(kuò)增片段的豐度。隨著PCR 反應(yīng)中目的片段含量的增加，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增強(qiáng)。從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。這種方法比普通的反轉(zhuǎn)錄PCR能更加直觀的反應(yīng)產(chǎn)物含量的多少給出定量的結(jié)果，與Northern Blotting相比更加簡潔直觀，目前是在對(duì)基因mRNA水平檢測(cè)最為常用的一種方法。

服務(wù)內(nèi)容

一、核酸提取

使用試劑盒或者Trizol法對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織，植物，酵母，真菌，細(xì)菌和土壤等樣品中的RNA和DNA進(jìn)行提取。并對(duì)提取的樣品進(jìn)行濃度和純度的檢測(cè)，作為后續(xù)檢測(cè)用模板。

二、RNA的反轉(zhuǎn)錄

與可以進(jìn)行直接檢測(cè)的DNA樣品不同，RNA樣品需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄為cDNA來進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。我們首先使用進(jìn)口的DNase對(duì)RNA樣品進(jìn)行處理，消除基因組DNA對(duì)后續(xù)檢測(cè)的干擾，再使用進(jìn)口反轉(zhuǎn)錄試劑盒或者反轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RNA樣品進(jìn)行高效的反轉(zhuǎn)錄，使得微量表達(dá)的樣品也能進(jìn)行很好的擴(kuò)增。

三、熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)量

根據(jù)檢測(cè)目的的不同，熒光定量PCR可以分為相對(duì)熒光定量PCR和絕對(duì)熒光定量PCR兩種。每種定量方法中根據(jù)檢測(cè)標(biāo)志物的不同分為染料法和探針法。較為常用的染料是SYBR Green，其能夠與DNA高度特異性的結(jié)合，具有很高的靈敏度。對(duì)于低表達(dá)量的樣品或特殊樣品，我們建議使用探針法進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)目的序列設(shè)計(jì)一條寡核苷酸探針，再標(biāo)記上熒光基團(tuán)，能夠極大的增加檢測(cè)靈敏度和特異性。可以檢測(cè)低至個(gè)位數(shù)的目的基因樣品。

四、特殊方法對(duì)待特殊樣品

我們擁有十年以上的核酸提取經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于特殊樣品，如土壤，我們優(yōu)化了傳統(tǒng)的Trizol方法，能夠高效的提取高純度的核酸樣品，可滿足后續(xù)熒光定量和高通量測(cè)序的需求。對(duì)于核酸含量很少的樣品，如拭子，環(huán)境水樣等。我們使用特殊的富集方法將樣品濃縮以減少樣品損失，再利用公司獨(dú)特的提取方法最大限度的提取樣品中的核酸，能夠滿足后續(xù)的檢測(cè)需求。此外，對(duì)于其它無可參考方法的樣品，我們可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)造屬于它的個(gè)性提取方法。

五、我們免費(fèi)提供

（1）引物和探針的設(shè)計(jì)，以及引物的合成；

（2）絕對(duì)定量和相對(duì)定量選擇的咨詢和建議；

（3）探針法和染料法選擇的咨詢和建議；

（4）核酸定量；

（5）內(nèi)參基因的檢測(cè)；

（6）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和分析；

（7）其它我們熒光定量PCR相關(guān)的能幫助到您的任何問題；

基本流程

服務(wù)收費(fèi)參考

客戶須知

1、待檢測(cè)樣品最好新鮮收集，如需累計(jì)樣品可將樣品放入-80保存以供DNA提取，或加入Trizol后-20保存以供RNA提取；

2、收集好的樣品應(yīng)盡快送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行核酸提取；

3、預(yù)實(shí)驗(yàn)開始前需提供待測(cè)基因序列或NCBI序列號(hào)以供引物設(shè)計(jì)和探針設(shè)計(jì)，客戶也可直接提供引物和探針序列進(jìn)行合成。

4、對(duì)于多種處理的樣品最好能夠提供陽性和陰性對(duì)照樣品；

5、我們可以免費(fèi)提供人，靈長類，大小鼠的內(nèi)參基因檢測(cè)，通常默認(rèn)的內(nèi)參基因?yàn)閎eta-actin，beta-tubulin，gapdh。如果需要檢測(cè)其它特殊的內(nèi)參基因請(qǐng)?zhí)崆案嬷?/span>

6、雙方簽訂合同后，收取預(yù)付后進(jìn)行試驗(yàn)；

7、如需參考國內(nèi)外文獻(xiàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)請(qǐng)?zhí)峁┫嚓P(guān)文獻(xiàn)依據(jù)；

8、血液，體液和糞便樣品需保證不含有傳染性病原體，如有特殊需求請(qǐng)?zhí)崆案嬷缥刺崆案嬷斐扇藛T危害的需追究法律責(zé)任；

公司提供

1、預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)結(jié)果（包括Ct值，拷貝數(shù)等）；

2、絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒和菌株；

3、剩余引物和探針及其序列信息；

4、實(shí)驗(yàn)報(bào)告