分子生物學

提供分子生物學相關技術服務：核酸提取、載體構建、蛋白表達與純化、CRISPR/Cas9介導的基因敲除細胞系和動物、實時熒光定量PCR等服務

CRISPR/Cas9介導的基因敲除細胞系篩選和建立

康朗生物可以通過自身T細胞和B細胞介導的免疫系統抵抗外源微生物的入侵和增殖，而低等的原核生物也有自己的應對策略完成自我保護。CRISPR/Cas9系統就是其中一項重要的武器，是細菌為應對病毒和質粒攻擊而演化來的一種獲得性免疫防御機制。CRISPR/Cas9系統中crRNA（CRISPR-derived RNA）通過堿基配對與tracrRNA（trans-activating RNA）結合形成雙鏈RNA。此tracrRNA/crRNA復合體作為引導員引導Cas9蛋白在crRNA引導序列靶定位點切斷雙鏈DNA。進一步通過細胞內同源重組等修復機制在切割位點缺失或插入不定長度的堿基序列，使得后續的細胞產生移碼突變，最終導致蛋白質活性的喪失。

在針對細胞的基因組編輯過程中，我們通常將tracrRNA和crRNA融合成為1條sgRNA克隆至表達載體上，同樣可以起到靶向剪切的作用。通過對Cas9核酸酶進行改造，使其可對任何物種的基因組進行高效定向的編輯，可有效避免脫靶效應。

服務內容

1. 敲除基因序列分析，并設計針對該序列的3-5條sgRNA

2. 將sgRNA與表達載體連接，篩選陽性sgRNA克隆；

3. sgRNA轉染細胞，流式分選GFP陽性細胞，篩選高效sgRNA；

4. 將sgRNA和Cas9質粒共轉染細胞，并篩選鑒定基因敲除細胞系敲除細胞株；

5. 基因敲除細胞株擴大培養，并通過熒光定量PCR和Western Blotting檢測基因敲除情況；

6. 細胞株傳代培養，并進行PCR二次鑒定。

實驗收費標準和周期

說明：關于基因敲除細胞系的篩選原則上進行一次轉染和流式篩選，公司確保篩選到單等位基因敲除細胞系。若未獲得雙等位基因敲除細胞系則再進行一次轉染和篩選。如果仍未獲得等位基因敲除細胞系則終止實驗，公司提供單等位基因敲除細胞系。

客戶須知

1. 請提供待敲除的細胞系和培養條件；

2. 請提供待敲除基因信息（基因名稱，物種，NCBI號等）；

3. 如有特殊要求（特定位點敲除等）請提前說明；

公司交付產物

1. 基因敲除細胞系兩管，每管細胞數目>1*106；

2. 敲除細胞系基因型鑒定結果；

3. 敲除細胞系熒光定量PCR和WB鑒定結果；

4. 實驗報告。

基因擴增，載體構建和蛋白表達純化

實驗原理

利用基因工程的基本原理和方法，將DNA或cDNA片段與載體連接，獲得能夠表達目的基因的載體。我們可以在目的基因上添加小分子量標簽（FLAG，HA，myc等）方便后續表達檢測。也能夠加入熒光標簽（GFP, RFP, CFP,BFP, YFP等）直觀的觀察蛋白表達情況。我們獨特的多順反子表達載體，可以同時表達多個蛋白，為研究蛋白相互作用或者多亞基蛋白共表達提供了極大的便利。根據客戶的需要，我們還可以對載體進行改造，滿足不同的實驗目的和要求。在進行基因功能學實驗時，通常要對基因的某些位點進行突變。我們通常使用高保真Pfu酶，利用重疊延伸PCR或者定點突變試劑盒的方法在目的基因中引入單個或多個堿基的突變，包括堿基的添加，刪除，替換等，從而對改變的目的蛋白進行性狀和表型的研究。對于未知基因的序列，Rapid-amplification of cDNA ends（RACE）方法可以滿足大家的要求。這是一種基于一段已知的cDNA片段，通過向兩端延伸擴增從而獲得完整的3'端和5'端的方法。本公司有多年RACE擴增經驗和優化后的實驗技術，能夠有效擴增大片段的未知序列。

服務內容

1．通過對序列進行分析，設計特異性引物擴增目的片段；

2．通過酶切連接或In-Fusion等方法，將目的片段克隆至表達載體上；

3．原核表達蛋白可通過IPTG等進行誘導表達，SDS-PAGE電泳檢測，Western Blotting檢測；

4．將真核表達載體轉染293T細胞，直接熒光觀察或Western Blotting檢測，驗證蛋白表達；

5．原核表達蛋白的大量表達和純化；

6．真核表達蛋白體內和體外功能研究（詳見細胞功能學實驗部分）；

7. 基因編碼區，非編碼區的單位點，大片段基因，高GC含量和重復序列基因的單位點和多位點突變；

8. 未知基因3’和5’RACE特異性引物的設計和3’和5’端片段的擴增；

載體構建基本流程

載體構建收費標準

注：基因組DNA或cDNA＞1ug；質粒＞100 ng；PCR產物＞100ug；

蛋白表達純化基本流程

蛋白表達和純化收費標準

基因定點突變基本流程

公司交付

1.含質粒的甘油菌和質粒（>5微克）

2. 測序結果和堿基序列圖

3 表達純化的蛋白和電泳圖

4. Western blotting檢測結果

5. 實驗報告

熒光定量PCR

實驗原理

在進行基因功能研究時，我們通常會通過觀察靶基因的表達量變化來判斷目的基因或藥物等對細胞的影響。靶基因的表達量變化可以通過在mRNA和蛋白水平進行檢測。蛋白水平通常使用Western Blotting方法進行（詳見WB檢測服務目錄），而在mRNA水平有多種方法進行檢測，比如反轉錄PCR，Northern Blotting和熒光定量PCR（RT-qPCR）等。熒光定量PCR方法由于其可以準確快速的對多個基因進行精確定量而得到廣泛的應用。該方法是一種基于普通PCR的改進方法，在PCR擴增的過程中利用具有DNA親和性的熒光染料或熒光標記的核苷酸探針，每個循環收集一次熒光強度信號。通過熒光強度的強弱反應擴增片段的豐度。隨著PCR 反應中目的片段含量的增加，熒光信號強度也等比例增強。從而實現對起始模板定量及定性的分析。這種方法比普通的反轉錄PCR能更加直觀的反應產物含量的多少給出定量的結果，與Northern Blotting相比更加簡潔直觀，目前是在對基因mRNA水平檢測最為常用的一種方法。

服務內容

一、核酸提取

使用試劑盒或者Trizol法對哺乳動物細胞和組織，植物，酵母，真菌，細菌和土壤等樣品中的RNA和DNA進行提取。并對提取的樣品進行濃度和純度的檢測，作為后續檢測用模板。

二、RNA的反轉錄

與可以進行直接檢測的DNA樣品不同，RNA樣品需要進行反轉錄為cDNA來進行進一步檢測。我們首先使用進口的DNase對RNA樣品進行處理，消除基因組DNA對后續檢測的干擾，再使用進口反轉錄試劑盒或者反轉錄酶對RNA樣品進行高效的反轉錄，使得微量表達的樣品也能進行很好的擴增。

三、熒光定量PCR檢測基因表達量

根據檢測目的的不同，熒光定量PCR可以分為相對熒光定量PCR和絕對熒光定量PCR兩種。每種定量方法中根據檢測標志物的不同分為染料法和探針法。較為常用的染料是SYBR Green，其能夠與DNA高度特異性的結合，具有很高的靈敏度。對于低表達量的樣品或特殊樣品，我們建議使用探針法進行檢測。根據目的序列設計一條寡核苷酸探針，再標記上熒光基團，能夠極大的增加檢測靈敏度和特異性。可以檢測低至個位數的目的基因樣品。

四、特殊方法對待特殊樣品

我們擁有十年以上的核酸提取經驗，對于特殊樣品，如土壤，我們優化了傳統的Trizol方法，能夠高效的提取高純度的核酸樣品，可滿足后續熒光定量和高通量測序的需求。對于核酸含量很少的樣品，如拭子，環境水樣等。我們使用特殊的富集方法將樣品濃縮以減少樣品損失，再利用公司獨特的提取方法最大限度的提取樣品中的核酸，能夠滿足后續的檢測需求。此外，對于其它無可參考方法的樣品，我們可以根據經驗創造屬于它的個性提取方法。

五、我們免費提供

（1）引物和探針的設計，以及引物的合成；

（2）絕對定量和相對定量選擇的咨詢和建議；

（3）探針法和染料法選擇的咨詢和建議；

（4）核酸定量；

（5）內參基因的檢測；

（6）數據統計和分析；

（7）其它我們熒光定量PCR相關的能幫助到您的任何問題；

基本流程

服務收費參考

客戶須知

1、待檢測樣品最好新鮮收集，如需累計樣品可將樣品放入-80保存以供DNA提取，或加入Trizol后-20保存以供RNA提取；

2、收集好的樣品應盡快送至實驗室進行核酸提取；

3、預實驗開始前需提供待測基因序列或NCBI序列號以供引物設計和探針設計，客戶也可直接提供引物和探針序列進行合成。

4、對于多種處理的樣品最好能夠提供陽性和陰性對照樣品；

5、我們可以免費提供人，靈長類，大小鼠的內參基因檢測，通常默認的內參基因為beta-actin，beta-tubulin，gapdh。如果需要檢測其它特殊的內參基因請提前告知；

6、雙方簽訂合同后，收取預付后進行試驗；

7、如需參考國內外文獻進行實驗請提供相關文獻依據；

8、血液，體液和糞便樣品需保證不含有傳染性病原體，如有特殊需求請提前告知，如未提前告知而造成人員危害的需追究法律責任；

公司提供

1、預實驗和正式實驗結果（包括Ct值，拷貝數等）；

2、絕對定量的標準品質粒和菌株；

3、剩余引物和探針及其序列信息；

4、實驗報告