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大鼠基質金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒操作概要

發表時間:2015-11-10

大鼠基質金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒操作概要

特別說明: 

*: [96T/48T](打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整) 

#: 一周內使用可存于4℃,需長時間存放或多次使用建議存于-20℃. 

相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些,請在使用時量取而非直接倒出!  

檢測原理: 

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗大鼠MMP-10抗體包被于酶標板上,實驗時樣品或標準

品中的大鼠MMP-10會與包被抗體結合,游離的成分被洗去。依次加入生物素化的抗大鼠MMP-10

抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗大鼠MMP-10抗體與結合在包被抗體上的大鼠MMP-10

結合、生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物,游離的成分被洗去。加入顯色底物(TMB),

TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色,加終止液后變成黃色。用酶標儀在450nm波長處測

OD值,MMP-10濃度與OD450值之間呈正比,通過繪制標準曲線計算出樣品中MMP-10的濃度。 

樣品收集: 

1. 血清:全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,收集

血液的試管應為一次性的無熱原,無內毒素試管。 

2. 血漿:抗凝劑推薦使用EDTA-Na2,樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘,取上清即可

檢測。避免使用溶血,高血脂樣品。 

3. 組織勻漿:用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細胞會

影響測量結果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS(一般按1:9的重量體

積比,比如1g的組織樣品對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,并做好記錄。

推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進一步裂解組

織細胞,可以對勻漿液進行超聲破碎,或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,

取上清檢測。 

4. 細胞培養上清:取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘,除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。 

5. 其它生物樣品:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測 

6. 樣品應清澈透明,懸浮物應離心去除。 

7. 樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃,若不能及時檢測,請按一次使用量分裝,凍

存于-20℃(1個月內檢測),或-80℃(6個月內檢測),避免反復凍融。 

8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值,請根據實際情況,做適當倍數稀釋(建議先

做預實驗,以確定稀釋倍數)。 

 大鼠基質金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒操作概要

試驗所需自備物品: 

1. 酶標儀(450nm波長濾光片) 

2. 高精度移液器,EP管及一次性吸頭:0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL 

3. 37℃恒溫箱,雙蒸水或去離子水 

4. 吸水紙 

 

檢測前準備工作: 

1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒,平衡至室溫。 

2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結

晶,屬于正常現象,可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液(加熱溫度不要超

過50℃,使用時洗滌液應為室溫)。當日使用。 

3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘,加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中,旋緊管蓋,

靜置10分鐘,上下顛倒數次,待其充分溶解后,用移液器將其輕輕混勻(濃度為10ng/mL)。

然后根據需要進行倍比稀釋(注:不要直接在反應孔中進行倍比稀釋)。建議配制成以下濃

度:10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0ng/mL,標準品&樣品稀釋液直接作為空白

孔0ng/mL。如配制5ng/mL標準品:取0.5mL10ng/mL的上述標準品加入含有0.5mL標準品&

樣品稀釋液的EP管中,混勻即可,其余濃度依此類推。  

4. 生物素化抗體工作液:實驗前計算當次實驗所需用量(以100μL/孔計),實際配制時應多配

制100-200μL。使用前15分鐘,以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作

濃度。當日使用。 

5. 酶結合物工作液:實驗前計算當次實驗所需用量(以100μL/孔計),實際配制時應多配制

100-200μL。使用前15分鐘,以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。

當日使用。 

標準品稀釋方法圖例:(以500μL/管為例,也可根據實際用量來稀釋,如200μL/管) 

 大鼠基質金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒操作概要

 1 2 3 4 5 6 7 8 Tube 

 10 5 2.5 1.25 0.625 0.313 0.156 0 ng/mL 

 

洗滌方法: 

1. 自動洗板機:每孔加入洗滌液350μL,注入與吸出間隔60秒。 

2. 手工洗板:甩盡孔內液體,在潔凈的吸水紙上拍干,每孔加洗滌液350μL,浸泡1-2分鐘,吸

去(不可觸及板壁)或甩掉酶標板內的液體,在厚的吸水紙上拍干。 

 

操作步驟: 

實驗開始前,各試劑均應平衡至室溫;試劑或樣品配制時,均需充分混勻,并盡量避免起泡。 

1. 加樣:分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 100μL,余孔分

別加標準品或待測樣品 100μL,注意不要有氣泡,加樣時將樣品加于酶標板底部,盡量不觸

及孔壁,輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜,37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性,每次

實驗請使用新的標準品溶液。 

2. 棄去液體,甩干,不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100μL(在使用前 15 分鐘

內配制),酶標板加上覆膜,37℃溫育 1 小時。 

3. 棄去孔內液體,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分鐘,大約 350μL/每孔,甩干并在吸水紙

上輕拍將孔內液體拍干。 

4. 每孔加酶結合物工作液(臨用前 15 分鐘內配制)100μL,加上覆膜,37℃溫育 30 分鐘。 

5. 棄去孔內液體,甩干,洗板 5 次,方法同步驟 3。 

6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL,酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右(根據實際顯色情 

況酌情縮短或延長,但不可超過 30 分鐘。當標準孔出現明顯梯度時,即可終止)。 

7. 每孔加終止液 50μL,終止反應,此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液

的加入順序相同。 

8. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度(OD 值)。應提前打開酶標儀電源,預熱儀

器,設置好檢測程序。 

9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存。 

 大鼠基質金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒操作概要

注意事項: 

1. 保存:試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強

光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染,否則可能會出現錯誤的結果。 

2. 酶標板:剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質,此為正常現象,不會對實驗結果造成

任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋,按推薦溫度存放! 

3. 加樣:加樣或加試劑時,第一個孔與最后一個孔的加樣時間間隔如果太大,將會導致不同的

“預溫育”時間,從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間最好控制在

10分鐘內。推薦設置復孔。 

4. 溫育:為防止樣品蒸發,實驗時必須給酶標板覆膜;洗板后應盡快進行下步操作,避免酶標

板處于干燥狀態;嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。 

5. 洗滌:洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干,勿將濾紙直接放入反應孔中吸

水。在讀數前要注意清除底部殘留的液體和手指印,以免影響酶標儀讀數。 

6. 試劑配制:Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較

小,運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋,因此使用前1000轉/分離心1min,以使附著管壁或瓶

蓋的液體沉積到管底。取用前,請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗

體工作液、酶結合物工作液請根據所需用量配制,并使用相應的稀釋液配制,不能混淆。請

精確配制標準品及工作液,盡量不要微量配制(如吸取Concentrated Biotinylated Detection 

Ab時,一次不要小于10μL),以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差;請勿重復使用已稀釋

過的標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次

用量分裝,將其放在-20~-80℃貯存。避免反復凍融。 

7. 顯色時間的控制:加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化(比如每隔5分鐘),如梯度已很

明顯,請提前加入終止液終止反應,避免顏色過深影響酶標儀讀數。 

8. 底物:底物請避光保存,在儲存和溫育時避免強光直接照射。 

9. 混勻:充分輕微混勻對反應結果尤為重要,最好使用微量振蕩器(使用最低頻率),如無微量

振蕩器,可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。 

10. 安全:試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品

時,請按國家生物試驗室安全防護條例執行。 

11. 不同批號的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應終止液除外) 

12. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用,嚴禁混用,否則將影響試驗結果! 

結果判斷: 

1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖,如設置復孔,則應取其平均值計算。以標準

品的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標,標準品的濃度

為縱坐標,繪出標準曲線。 

2. 推薦使用專業的曲線制作軟件,如curve expert 1.3或1.4,在軟件界面既可根據樣品OD值,

由標準曲線查出相應的濃度,乘以稀釋倍數;亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程

式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋倍數,即為樣品的實際濃度。 

3. 若樣品OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數。 

大鼠基質金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒操作概要

靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性: 

●靈敏度:最小可測 0.094ng/mL。 

●檢測范圍:0.156–10ng/mL。 

● 特異性:可檢測重組或天然的大鼠 MMP-10,且與其它相關蛋白無交叉反應。 

● 重復性:板內,板間變異系數均<10%。 

 

操作概要 

1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL, 37℃孵育 90 分鐘 

2. 倒去孔內液體,加入 100μL 生物素化抗體工作液,37℃孵育 60 分鐘 

3. 洗滌 3 次 

4. 加入 100μL 酶結合物工作液, 37℃孵育 30 分鐘 

5. 洗滌 5 次 

6. 加入 90μL 底物溶液, 37℃孵育 15 分鐘左右 

7. 加入 50μL 終止液,立即在 450nm 波長處測量 OD 值 

8. 結果計算


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