大鼠細胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要
特別說明：
*: [96T/48T]（打開包裝后請及時檢查所有物品是否齊全完整）
#: 一周內使用可存于4℃，需長時間存放或多次使用建議存于-20℃.
相關試劑在分裝時會比標簽上標明的體積稍多一些，請在使用時量取而非直接倒出！
檢測原理:
本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法。用抗大鼠sICAM-1/CD54抗體包被于酶標板上，實驗時樣品
或標準品中的大鼠sICAM-1/CD54會與包被抗體結合，游離的成分被洗去。依次加入生物素化的
抗大鼠sICAM-1/CD54抗體和辣根過氧化物酶標記的親和素。抗大鼠sICAM-1/CD54抗體與結合在
包被抗體上的大鼠sICAM-1/CD54結合、生物素與親和素特異性結合而形成免疫復合物，游離的
成分被洗去。加入顯色底物(TMB)，TMB在辣根過氧化物酶的催化下呈現藍色，加終止液后變成
黃色。用酶標儀在450nm波長處測OD值，sICAM-1/CD54濃度與OD450值之間呈正比，通過繪制
標準曲線計算出樣品中sICAM-1/CD54的濃度。
大鼠細胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要樣品收集:
1. 血清：全血樣品于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測，收集
血液的試管應為一次性的無熱原，無內毒素試管。
2. 血漿：抗凝劑推薦使用EDTA-Na2，樣品采集后30分鐘內于1000×g離心15分鐘，取上清即可
檢測。避免使用溶血，高血脂樣品。
3. 組織勻漿：用預冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細胞會
影響測量結果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應體積的PBS（一般按1:9的重量體
積比，比如1g的組織樣品對應9mL的PBS，具體體積可根據實驗需要適當調整，并做好記錄。
推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進一步裂解組
織細胞，可以對勻漿液進行超聲破碎，或反復凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘，
取上清檢測。
4. 細胞培養上清：取細胞培養上清于1000×g離心20分鐘，除去雜質及細胞碎片。取上清檢測。
5. 其它生物樣品：1000×g離心20分鐘，取上清即可檢測
6. 樣品應清澈透明，懸浮物應離心去除。
7. 樣品收集后若在1周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍
存于-20℃(1個月內檢測)，或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融。
8. 如果您的樣品中檢測物濃度高于標準品最高值，請根據實際情況，做適當倍數稀釋（建議先
做預實驗，以確定稀釋倍數）。
試驗所需自備物品:
1. 酶標儀(450nm波長濾光片)
2. 高精度移液器，EP管及一次性吸頭：0.5-10μL, 2-20μL, 20-200μL, 200-1000μL
3. 37℃恒溫箱，雙蒸水或去離子水
4. 吸水紙
大鼠細胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要
檢測前準備工作:
1. 請提前20分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫。
2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回4℃。從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結
晶，屬于正常現象，可用40℃水浴微加熱使結晶完全溶解后再配制洗滌液（加熱溫度不要超
過50℃，使用時洗滌液應為室溫）。當日使用。
3. 標準品: 于10000×g離心1分鐘，加入標準品&樣品稀釋液1.0mL至凍干標準品中，旋緊管蓋，
靜置10分鐘，上下顛倒數次，待其充分溶解后，用移液器將其輕輕混勻（濃度為2000pg/mL）。
然后根據需要進行倍比稀釋（注：不要直接在反應孔中進行倍比稀釋）。建議配制成以下濃
度：2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、0pg/mL，標準品&樣品稀釋液直接作為空
白孔0pg/mL。如配制1000pg/mL標準品：取0.5mL2000pg/mL的上述標準品加入含有0.5mL標
準品&樣品稀釋液的EP管中，混勻即可，其余濃度依此類推。
4. 生物素化抗體工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配
制100-200μL。使用前15分鐘，以生物素化抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)成工作
濃度。當日使用。
5. 酶結合物工作液：實驗前計算當次實驗所需用量（以100μL/孔計），實際配制時應多配制
100-200μL。使用前15分鐘，以酶結合物稀釋液稀釋濃縮HRP酶結合物(1:100)成工作濃度。
當日使用。
標準品稀釋方法圖例：（以500μL/管為例，也可根據實際用量來稀釋，如200μL/管）
1 2 3 4 5 6 7 8 Tube
2000 1000 500 250 125 62.5 31.25 0 pg/mL
大鼠細胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要
洗滌方法:
1. 自動洗板機：每孔加入洗滌液350μL，注入與吸出間隔60秒。
2. 手工洗板：甩盡孔內液體，在潔凈的吸水紙上拍干，每孔加洗滌液350μL，浸泡1-2分鐘，吸
去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內的液體，在厚的吸水紙上拍干。
操作步驟:
實驗開始前，各試劑均應平衡至室溫；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，并盡量避免起泡。
1. 加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔。空白孔加標準品&樣品稀釋液 100μL，余孔分
別加標準品或待測樣品 100μL，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動混勻。給酶標板覆膜，37℃孵育 90 分鐘。為保證實驗結果有效性，每次
實驗請使用新的標準品溶液。
2. 棄去液體，甩干，不用洗滌。每個孔中加入生物素化抗體工作液 100μL（在使用前 15 分鐘
內配制），酶標板加上覆膜，37℃溫育 1 小時。
3. 棄去孔內液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡 1-2 分鐘，大約 350μL/每孔，甩干并在吸水紙
上輕拍將孔內液體拍干。
4. 每孔加酶結合物工作液（臨用前 15 分鐘內配制）100μL，加上覆膜，37℃溫育 30 分鐘。
5. 棄去孔內液體，甩干，洗板 5 次，方法同步驟 3。
6. 每孔加底物溶液(TMB)90μL，酶標板加上覆膜 37℃避光孵育 15 分鐘左右（根據實際顯色情
況酌情縮短或延長，但不可超過 30 分鐘。當標準孔出現明顯梯度時，即可終止）。
7. 每孔加終止液 50μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物溶液
的加入順序相同。
8. 立即用酶標儀在 450nm 波長測量各孔的光密度（OD 值）。應提前打開酶標儀電源，預熱儀
器，設置好檢測程序。
9. 實驗完畢后將未用完的試劑按規定的保存溫度放回冰箱保存。
注意事項：
1. 保存：試劑盒中各試劑請按說明書提示合理存放。在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強
光中。所有試劑瓶蓋須旋緊以防止蒸發和微生物的污染，否則可能會出現錯誤的結果。
2. 酶標板：剛開啟的酶標板孔中可能會有少許水樣物質，此為正常現象，不會對實驗結果造成
任何影響。暫時不用的板條應拆卸后放入備用鋁箔袋，按推薦溫度存放！
3. 加樣：加樣或加試劑時，第一個孔與最后一個孔的加樣時間間隔如果太大，將會導致不同的
“預溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復性。每次的加樣時間最好控制在
10分鐘內。推薦設置復孔。
4. 溫育：為防止樣品蒸發，實驗時必須給酶標板覆膜；洗板后應盡快進行下步操作，避免酶標
板處于干燥狀態；嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
5. 洗滌：洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在吸水紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應孔中吸
水。在讀數前要注意清除底部殘留的液體和手指印，以免影響酶標儀讀數。
6. 試劑配制：Concentrated Biotinylated Detection Ab及Concentrated HRP Conjugate體積較
小，運輸過程會使液體沾到管壁或瓶蓋，因此使用前1000轉/分離心1min，以使附著管壁或瓶
蓋的液體沉積到管底。取用前，請用移液器小心吹打4-5次使溶液混勻。標準品、生物素化抗
體工作液、酶結合物工作液請根據所需用量配制，并使用相應的稀釋液配制，不能混淆。請
精確配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取Concentrated Biotinylated Detection
Ab時，一次不要小于10μL），以避免由于不準確稀釋而造成濃度誤差；請勿重復使用已稀釋
過的標準品、生物素化抗體工作液、酶結合物工作液。若需要分次使用標準品應按照每一次
用量分裝，將其放在-20～-80℃貯存。避免反復凍融。
7. 顯色時間的控制：加入底物后請定時觀察反應孔的顏色變化（比如每隔5分鐘），如梯度已很
明顯，請提前加入終止液終止反應，避免顏色過深影響酶標儀讀數。
8. 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
9. 混勻：充分輕微混勻對反應結果尤為重要，最好使用微量振蕩器(使用最低頻率)，如無微量
振蕩器，可在反應前手工輕輕敲擊酶標板框混勻。
10. 安全：試驗中請穿著實驗服并帶乳膠手套做好防護工作。特別是檢測血液或者其他體液樣品
時，請按國家生物試驗室安全防護條例執行。
11. 不同批號的試劑盒組份不能混用（洗滌液和反應終止液除外）
12. 試驗中所用的EP管和吸頭均為一次性使用，嚴禁混用，否則將影響試驗結果！
結果判斷:
1. 每個標準品的OD值減去空白孔的OD值后作圖，如設置復孔，則應取其平均值計算。以標準
品的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出標準曲線。亦可以OD值為橫坐標，標準品的濃度
為縱坐標，繪出標準曲線。
2. 推薦使用專業的曲線制作軟件，如curve expert 1.3或1.4，在軟件界面既可根據樣品OD值，
由標準曲線查出相應的濃度，乘以稀釋倍數；亦可將樣品的OD值代入標準曲線的擬合方程
式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為樣品的實際濃度。
3. 若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。
大鼠細胞間粘附分子1(sICAM-1/CD54)ELISA試劑盒操作概要
靈敏度、檢測范圍、特異性和重復性:
●靈敏度：最小可測 18.75pg/mL。
●檢測范圍：31.25–2000pg/mL。
● 特異性：可檢測重組或天然的大鼠 sICAM-1/CD54，且與其它相關蛋白無交叉反應。
● 重復性：板內，板間變異系數均<10%。
操作概要
1. 在各孔中加入標準品或樣品各 100μL， 37℃孵育 90 分鐘
2. 倒去孔內液體，加入 100μL 生物素化抗體工作液，37℃孵育 60 分鐘
3. 洗滌 3 次
4. 加入 100μL 酶結合物工作液， 37℃孵育 30 分鐘
5. 洗滌 5 次
6. 加入 90μL 底物溶液， 37℃孵育 15 分鐘左右
7. 加入 50μL 終止液，立即在 450nm 波長處測量 OD 值
8. 結果計算
