ELISA實驗操作中常見問題分析

由于 ELISA(酶聯免疫試驗)具有靈敏度較高、特異性好的特點，已廣泛應用于各種傳染性疾病的篩查如肝炎、愛滋、優生優育等。雖然洗板只是ELISA實驗重要環節中的一個，但作為專業的洗板機生產廠家，我們必須對影響ELISA實驗結果各因素有一定的認識。優質的 試劑 ，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。如不注意，就易出現白板、花板、色弱和假陽性等現象。尤其是花板現象（就是空白、陰性、陽性對照以及室內質控孔結果正常，而標本孔的OD值卻明顯偏高）是各個廠家洗板機調試中經常遇到的問題。現將ELISA實驗操作中注意事項總結如下，以期給大家帶來一些啟發，以改善洗板機的安裝調試水平，提高臨床檢測質量。      1 標本及采集、貯運因素   嚴重溶血 ，以 HRP 為標記的ELISA 測定中，殘留在孔內的血紅蛋白具有過氧化物酶樣活性，催化底物顯色造成假陽性； 混有紅細胞的血清 易沉淀或附著在聚乙烯孔內不易洗凈；如有 細菌污染 ，菌體中可能含有內源性HRP，也會產生假陽性反應； 標本凝固不全 ，有時為了爭取時間快速檢測，常在血液還未開始凝固時即強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白原，在ELISA測定過程中可以形成肉眼可見的纖維蛋白塊，易造成假陽性結果； 采血試管洗滌不徹底 、反復使用易交叉污染； 塑料試管能吸附抗原物質 ，樣本久置在塑料管內會使樣本內抗原含量下降造成假陰性。       血清標本宜在新鮮時檢測，嚴重溶血標本禁用。一般說來，在 5 天內測定的血清標本可放置于4℃，標本在冰箱中保存時間過長導致血清IgG 聚合，使間接法的 試劑 本底加深。超過一周測定的需－20℃保存。凍結血清融解后，蛋白質局部濃縮，分布不均，應充分混勻并避免產生氣泡。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾，澄清后再檢測。反復凍融會使 抗體 效價跌落，所以測 抗體 的血清標本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存；最好使用一次性玻璃試管或真空管采血管；并使用非抗凝標本，肝素抗凝血漿會增加OD值，可能與高濃度肝素具有強大的負電荷能吸附酶標記物不易洗脫有關；EDTA、酶抑制劑（如NaN3）可抑制ELISA系統中辣根過氧化物酶活性；血液標本采集后必須使其充分凝固后再分離血清，或標本采集時用帶分離膠的采血管或于采血管中加入適當的促凝劑。  2、試劑的影響       ELISA 診斷試劑經歷了從合成肽向基因工程抗原的過渡。由于歷史的原因，人們往往以反應本底的好壞來衡量ELISA 反應 試劑 盒，因此有些廠家為了保持較好的本底采用了單片段基因工程抗原及合成肽包被，該類 試劑 盒的流行病學敏感度不夠，穩定性也成問題。也有廠家堅持 試劑 盒高的流行病學敏感度，科學地對待反應結果。基因工程抗原較合成肽抗原有無可比擬的優越性，就HCV-ELISA 試劑 盒來講，第一代產品為合成肽抗原，主要是HCV 特異性抗原決定簇的肽片段；第二代產品包被的抗原既有基因工程抗原又有合成肽，只是當時的基因工程抗原不全，僅包括了HCV 的核心區片段；第三代產品基本上采用了基因工程抗原，而且這些抗原包括更多、更穩定、純度更高的HCV 特異性抗原。第三代 試劑 的敏感度大大提高了。基因工程抗原與合成肽抗原的區別如下：       基因工程抗原是抗原基因在質粒載體中原核或真核表達的蛋白質抗原，多以大腸桿菌或 酵母 菌為表達系統。該類抗原與合成肽相比具有以下特點：   a.分子量大。合成肽采用化學方法制備，由于工藝的局限，合成數量有限，只能達到數百個氨基酸；而利用基因工程制備的抗原，分子量更大。   b.穩定性好。包被的抗原的穩定性可使 試劑 盒的效期得到保證，早期以合成肽為包被抗原的 試劑 盒效期只有3-4 個月，采用基因工程抗原后效期大大延長了。