你要的細(xì)胞凋亡檢測方法都在這了

細(xì)胞凋亡檢測可以：

1. 用于腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本研究；

2. 應(yīng)用于臨床診療，新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；

3. 對相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。

細(xì)胞凋亡的檢測方法有很多，下面介紹 7 種常用的測定方法。

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形態(tài)學(xué)檢測法

實驗方法原理

根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，使用合適的顯微鏡檢測凋亡細(xì)胞形態(tài)變化。

1. 光學(xué)顯微鏡和倒置顯微鏡

   （1）未染色細(xì)胞：凋亡細(xì)胞的體積變小、變形，細(xì)胞膜完整但出現(xiàn)發(fā)泡現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。貼壁細(xì)胞出現(xiàn)皺縮、變圓、脫落。

   （2）染色細(xì)胞：常用姬姆薩染色、瑞氏染色等。凋亡細(xì)胞的染色質(zhì)濃縮、邊緣化，核膜裂解、染色質(zhì)分割成塊狀和凋亡小體等典型的凋亡形態(tài)。

2. 熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡

   一般以細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)來評判細(xì)胞凋亡的進(jìn)展情況。

   常用的 DNA 特異性染料有：HO 33342 （Hoechst 33342），HO 33258 （Hoechst 33258），DAPI。三種種染料與 DNA 的結(jié)合是非嵌入式的，主要結(jié)合在 DNA 的 A-T 堿基區(qū)。紫外光激發(fā)時發(fā)射明亮的藍(lán)色熒光。

   Hoechst 是與 DNA 特異結(jié)合的活性染料，儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度，使用時用 PBS 稀釋，終濃度為 10 ug/ml。

   DAPI 為半通透性，用于常規(guī)固定細(xì)胞的染色。儲存液用蒸餾水配成 1 mg/ml 的濃度，使用終濃度一般為 10 ug/ml。

   結(jié)果評判：細(xì)胞凋亡過程中細(xì)胞核染色質(zhì)的形態(tài)學(xué)改變分為三期：Ⅰ期的細(xì)胞核呈波紋狀（rippled）或呈折縫樣（creased），部分染色質(zhì)出現(xiàn)濃縮狀態(tài)；Ⅱa 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；Ⅱb 期的細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體 （圖 1）。

   

3. 透射電子顯微鏡觀察

   結(jié)果評判：凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮。凋亡Ⅰ期（pro-apoptosis nuclei）的細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)高度盤繞，出現(xiàn)許多稱為氣穴現(xiàn)象（cavitations）的空泡結(jié)構(gòu) （圖 2）；Ⅱa 期細(xì)胞核的染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化；細(xì)胞凋亡的晚期，細(xì)胞核裂解為碎塊，產(chǎn)生凋亡小體。

   

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磷脂酰絲氨酸外翻分析（Annexin-V）法態(tài)學(xué)

磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS 可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中 （圖 3）。Annexin-V 是一種分子量為 35～36 KD 的 Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與 PS 高親和力特異性結(jié)合。將 Annexin-V 進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或 biotin 標(biāo)記，以標(biāo)記了的 Annexin-V 作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

碘化丙啶 （propidine iodide,PI） 是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI 能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將 Annexin-V 與 PI 匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。

實驗步驟

1. 懸浮細(xì)胞的染色

   將正常培養(yǎng)和誘導(dǎo)凋亡的懸浮細(xì)胞（0.5～1×106）用 PBS 洗 2 次，加入 100 ul Binding Buffer 和 FITC 標(biāo)記的 Annexin-V（20 ug/ml）10 ul，室溫避光 30 min，再加入 PI（50 ug/ml）5 ul，避光反應(yīng) 5 min 后，加入 400 ul Binding Buffer，立即用 FACScan 進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)定量檢測（一般不超過 1 h）， 同時以不加 AnnexinV-FITC 及 PI 的一管作為陰性對照。

2. 貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞染色

   先用 0.25% 的胰酶消化，洗滌、染色和分析同懸浮細(xì)胞。

3. 爬片細(xì)胞染色

   同上，最后用熒光顯微鏡和共聚焦激光掃描顯微鏡進(jìn)行觀察。

4. 結(jié)果