沈健
第二軍醫(yī)大學(xué)
一、背景與目的動(dòng)脈粥樣硬化被認(rèn)為有炎癥因素參與其病理過程,而其炎癥過程與單核細(xì)胞和單核細(xì)胞來源巨噬細(xì)胞的招募、活化以及單核細(xì)胞的分化相關(guān),且與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性及動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的預(yù)后相關(guān)。然而,由于單核細(xì)胞半衰期較短,如果缺少自噬,循環(huán)血中的單核細(xì)胞將會(huì)自然凋亡。目前已知主要的可誘導(dǎo)單核細(xì)胞自噬的刺激物主要有粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)和巨噬細(xì)胞刺激因子(M-CSF)。目前認(rèn)為自噬是一個(gè)普遍存在于真核細(xì)胞中、可通過雙層膜結(jié)構(gòu)的囊泡降解或回收不需要或無功能的細(xì)胞組分以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、抗衰老以及細(xì)胞發(fā)育的過程。其過程中,微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (LC3)以及泛素樣結(jié)合蛋白p62/SQSTM1均為重要標(biāo)志蛋白,故常作為檢測(cè)自噬活性的常用指標(biāo)之一。短鏈非編碼RNA中微小核糖核酸(microRNA, miRNA, miR-)可對(duì)廣泛細(xì)胞各種生物學(xué)活動(dòng)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。故我們?cè)O(shè)計(jì)本研究旨在探討miRNA在單核細(xì)胞自噬中的表達(dá)情況及其調(diào)控作用。我們通過將THP-1人單核細(xì)胞置于M-CSF刺激環(huán)境下,誘導(dǎo)單核細(xì)胞發(fā)生自噬,檢測(cè)miRNA表達(dá)情況,篩查表達(dá)變化最為顯著的miRNA,并進(jìn)一步將其在單核細(xì)胞中過表達(dá)來觀察細(xì)胞自噬活性的變化。進(jìn)而探討該miRNA調(diào)控M-CSF誘導(dǎo)的THP-1人單核細(xì)胞自噬的潛在靶基因。二、研究方法(一)THP-1人單核細(xì)胞的培養(yǎng)THP-1人單核細(xì)胞培養(yǎng)條件為完全1640培養(yǎng)基(90%RPMI-1640+10%胎牛血清+1%P/S)。誘導(dǎo)自噬條件為在完全1640培養(yǎng)液中加入M-CSF至100ng/ml。(二)流式細(xì)胞檢測(cè)THP-1人單核細(xì)胞按上述方法培養(yǎng),CYTO-ID自噬檢測(cè)試劑盒中綠色染劑染色后用流式細(xì)胞儀的綠(FL1)通道分析樣本。(三)蛋白免疫印跡(Western blot)單核細(xì)胞樣品采用HelixGenRIPA裂解液提取蛋白,對(duì)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62/SQSTMI以及GAPDH等蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。一抗?jié)舛热缦?anti-LC3(1:1000)、anti-p62 (1:1000)、anti-GAPDH (1:1000)。二抗?jié)舛热缦?anti-rabbit(1:10000)、anti-mouse (1:5000)。蛋白條帶應(yīng)用 BIORADFlour-SMuiltilmager 成像系統(tǒng)檢測(cè)。(四)透射電子顯微鏡單核細(xì)胞經(jīng)M-CSF處理后使用多聚甲醛固定液4℃固定6h以上后送檢,電鏡下觀察到雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡狀的自噬體作為自噬定性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)。(五)Agilent miRNA 芯片應(yīng)用mirVana RNA提取試劑盒提取total RNA,芯片雜交后應(yīng)用Aglient G2505C掃描儀中選擇相應(yīng)的參數(shù)掃描。(六)實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)應(yīng)用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取THP-1人單核細(xì)胞的miRNA,應(yīng)用miRcute增強(qiáng)型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,miRcute增強(qiáng)型miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行qRT-PCR,使用Roche LightCycler分析儀進(jìn)行檢測(cè)分析,以U6作為內(nèi)參計(jì)算ACt值,以2-△△Ct法計(jì)算目標(biāo)miRNA相對(duì)表達(dá)水平。(七)腺病毒構(gòu)建及細(xì)胞轉(zhuǎn)染構(gòu)建重組腺病毒并擴(kuò)增、測(cè)定滴度,繼而通過腺病毒將miR-301b-3p轉(zhuǎn)染入單核細(xì)胞。采用qRT-PCR方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。(八)雙熒光素酶報(bào)告基因分別將MYB和CYLD的mRNA 3’UTR融合至熒光素酶質(zhì)粒中,再將質(zhì)粒分別與miR-301b-3p類似物共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,24 h后裂解細(xì)胞,應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性并定量分析。(九)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每組的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)至少3次。兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn),多個(gè)組間比較采用單因素ANOVA分析。以P<0.05作為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。三、結(jié)果(一)M-CSF誘導(dǎo)THP-1人單核細(xì)胞自噬M-CSF誘導(dǎo)處理后,應(yīng)用CYTO-ID自噬檢測(cè)試劑盒對(duì)THP-1人單核細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)顯示處理6 h時(shí)細(xì)胞自噬水平顯著升高;Western blot顯示LC3II/1比值顯著高于對(duì)照組、p62/SQSTM1顯著低于對(duì)照組,應(yīng)用巴弗洛霉素A1抑制溶酶體活性后,相同處理?xiàng)l件下LC3Ⅱ/Ⅰ比值進(jìn)一步增高、p62/SQSTM1則高于對(duì)照組;透射電子顯微鏡觀察到M-CSF處理6 h時(shí)單核細(xì)胞內(nèi)形成雙側(cè)膜結(jié)構(gòu)自噬體,而對(duì)照組則未觀察到該現(xiàn)象。上述結(jié)果均證實(shí)在M-CSF處理6 h后單核細(xì)胞自噬被顯著激活。(二)miRNA表達(dá)情況Agilent miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果提示與對(duì)照組相比,M-CSF處理6 h時(shí)單核細(xì)胞表達(dá) miRNA 中 miR-1249-3p、miR-301b-3p、miR-4653-3p、miR-513a-5p、miR-6734-5p存在顯著差異,進(jìn)一步應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)驗(yàn)證miR-301b-3p表達(dá)顯著增高。(三)過表達(dá)miR-301b-3p促進(jìn)M-CSF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞自噬用miR-301b-3p轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞,48 h時(shí)qRT-PCR檢測(cè)顯示miR-301b-3p表達(dá)量與對(duì)照組相比顯著增高,提示轉(zhuǎn)染有效。M-CSF誘導(dǎo)單核細(xì)胞發(fā)生自噬,繼而應(yīng)用Western blot檢測(cè)顯示miR-301b-3p過表達(dá)后LC311/I1比值顯著增高、p62/SQSTM1顯著降低,提示過表達(dá)miR-301b-3p進(jìn)一步促進(jìn)M-CSF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞自噬。(四)靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證應(yīng)用TargetScan、microRNAorg等數(shù)據(jù)庫檢索預(yù)測(cè)篩選顯示MYB、CYLD可能為miR-301b-3p的潛在靶基因,其3’UTR含有miR-301b-3p可能的結(jié)合位點(diǎn)且保守性較好,故本研究應(yīng)用熒光素酶報(bào)告基因方法驗(yàn)證MYB與CYLD是否為miR-301b-3p的靶基因。結(jié)果顯示過表達(dá)miR-301b-3p可顯著抑制MYB-3’UTR與CYLD-3’URT的熒光素酶表達(dá),提示MYB與CYLD為miR-301b-3p的直接靶基因。四、結(jié)論(一)M-CSF能夠誘導(dǎo)THP-1人單核細(xì)胞發(fā)生自噬,在誘導(dǎo)6 h后自噬活性水平顯著增高。(二)在M-CSF能夠誘導(dǎo)THP-1人單核細(xì)胞自噬時(shí),miR-301b-3p表達(dá)顯著增高。(三)過表達(dá)miR-301b-3p能促進(jìn)M-CSF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞自噬。(四)miR-301b-3p靶向作用于MYB與CYLD,可能通過該途徑實(shí)現(xiàn)促進(jìn)M-CSF誘導(dǎo)的單核細(xì)胞自噬。 還原
微小核糖核酸; 單核細(xì)胞; 自噬; 巨噬細(xì)胞刺激因子;
趙仙先;
R543.5
（與０ｈ組
圖２－５ｍｉＲ－３
