沈健
第二軍醫大學
一、背景與目的動脈粥樣硬化被認為有炎癥因素參與其病理過程,而其炎癥過程與單核細胞和單核細胞來源巨噬細胞的招募、活化以及單核細胞的分化相關,且與動脈粥樣硬化斑塊穩定性及動脈粥樣硬化性疾病的預后相關。然而,由于單核細胞半衰期較短,如果缺少自噬,循環血中的單核細胞將會自然凋亡。目前已知主要的可誘導單核細胞自噬的刺激物主要有粒細胞巨噬細胞刺激因子(GM-CSF)和巨噬細胞刺激因子(M-CSF)。目前認為自噬是一個普遍存在于真核細胞中、可通過雙層膜結構的囊泡降解或回收不需要或無功能的細胞組分以維持細胞穩態、抗衰老以及細胞發育的過程。其過程中,微管相關蛋白輕鏈3 (LC3)以及泛素樣結合蛋白p62/SQSTM1均為重要標志蛋白,故常作為檢測自噬活性的常用指標之一。短鏈非編碼RNA中微小核糖核酸(microRNA, miRNA, miR-)可對廣泛細胞各種生物學活動進行轉錄后調控。故我們設計本研究旨在探討miRNA在單核細胞自噬中的表達情況及其調控作用。我們通過將THP-1人單核細胞置于M-CSF刺激環境下,誘導單核細胞發生自噬,檢測miRNA表達情況,篩查表達變化最為顯著的miRNA,并進一步將其在單核細胞中過表達來觀察細胞自噬活性的變化。進而探討該miRNA調控M-CSF誘導的THP-1人單核細胞自噬的潛在靶基因。二、研究方法(一)THP-1人單核細胞的培養THP-1人單核細胞培養條件為完全1640培養基(90%RPMI-1640+10%胎牛血清+1%P/S)。誘導自噬條件為在完全1640培養液中加入M-CSF至100ng/ml。(二)流式細胞檢測THP-1人單核細胞按上述方法培養,CYTO-ID自噬檢測試劑盒中綠色染劑染色后用流式細胞儀的綠(FL1)通道分析樣本。(三)蛋白免疫印跡(Western blot)單核細胞樣品采用HelixGenRIPA裂解液提取蛋白,對LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62/SQSTMI以及GAPDH等蛋白表達情況進行檢測。一抗濃度如下:anti-LC3(1:1000)、anti-p62 (1:1000)、anti-GAPDH (1:1000)。二抗濃度如下:anti-rabbit(1:10000)、anti-mouse (1:5000)。蛋白條帶應用 BIORADFlour-SMuiltilmager 成像系統檢測。(四)透射電子顯微鏡單核細胞經M-CSF處理后使用多聚甲醛固定液4℃固定6h以上后送檢,電鏡下觀察到雙層膜結構囊泡狀的自噬體作為自噬定性檢測標準。(五)Agilent miRNA 芯片應用mirVana RNA提取試劑盒提取total RNA,芯片雜交后應用Aglient G2505C掃描儀中選擇相應的參數掃描。(六)實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)應用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取THP-1人單核細胞的miRNA,應用miRcute增強型miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒進行反轉錄,miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒進行qRT-PCR,使用Roche LightCycler分析儀進行檢測分析,以U6作為內參計算ACt值,以2-△△Ct法計算目標miRNA相對表達水平。(七)腺病毒構建及細胞轉染構建重組腺病毒并擴增、測定滴度,繼而通過腺病毒將miR-301b-3p轉染入單核細胞。采用qRT-PCR方法檢測轉染效率。(八)雙熒光素酶報告基因分別將MYB和CYLD的mRNA 3’UTR融合至熒光素酶質粒中,再將質粒分別與miR-301b-3p類似物共轉染至293T細胞中,24 h后裂解細胞,應用雙熒光素酶報告系統試劑盒測定熒光素酶活性并定量分析。(九)統計學分析計量資料以平均數±標準差表示,每組的實驗數據重復至少3次。兩組間比較采用兩獨立樣本的t檢驗,多個組間比較采用單因素ANOVA分析。以P<0.05作為顯著性差異標準。三、結果(一)M-CSF誘導THP-1人單核細胞自噬M-CSF誘導處理后,應用CYTO-ID自噬檢測試劑盒對THP-1人單核細胞進行流式細胞檢測顯示處理6 h時細胞自噬水平顯著升高;Western blot顯示LC3II/1比值顯著高于對照組、p62/SQSTM1顯著低于對照組,應用巴弗洛霉素A1抑制溶酶體活性后,相同處理條件下LC3Ⅱ/Ⅰ比值進一步增高、p62/SQSTM1則高于對照組;透射電子顯微鏡觀察到M-CSF處理6 h時單核細胞內形成雙側膜結構自噬體,而對照組則未觀察到該現象。上述結果均證實在M-CSF處理6 h后單核細胞自噬被顯著激活。(二)miRNA表達情況Agilent miRNA芯片檢測結果提示與對照組相比,M-CSF處理6 h時單核細胞表達 miRNA 中 miR-1249-3p、miR-301b-3p、miR-4653-3p、miR-513a-5p、miR-6734-5p存在顯著差異,進一步應用qRT-PCR檢測驗證miR-301b-3p表達顯著增高。(三)過表達miR-301b-3p促進M-CSF誘導的單核細胞自噬用miR-301b-3p轉染單核細胞,48 h時qRT-PCR檢測顯示miR-301b-3p表達量與對照組相比顯著增高,提示轉染有效。M-CSF誘導單核細胞發生自噬,繼而應用Western blot檢測顯示miR-301b-3p過表達后LC311/I1比值顯著增高、p62/SQSTM1顯著降低,提示過表達miR-301b-3p進一步促進M-CSF誘導的單核細胞自噬。(四)靶基因預測及驗證應用TargetScan、microRNAorg等數據庫檢索預測篩選顯示MYB、CYLD可能為miR-301b-3p的潛在靶基因,其3’UTR含有miR-301b-3p可能的結合位點且保守性較好,故本研究應用熒光素酶報告基因方法驗證MYB與CYLD是否為miR-301b-3p的靶基因。結果顯示過表達miR-301b-3p可顯著抑制MYB-3’UTR與CYLD-3’URT的熒光素酶表達,提示MYB與CYLD為miR-301b-3p的直接靶基因。四、結論(一)M-CSF能夠誘導THP-1人單核細胞發生自噬,在誘導6 h后自噬活性水平顯著增高。(二)在M-CSF能夠誘導THP-1人單核細胞自噬時,miR-301b-3p表達顯著增高。(三)過表達miR-301b-3p能促進M-CSF誘導的單核細胞自噬。(四)miR-301b-3p靶向作用于MYB與CYLD,可能通過該途徑實現促進M-CSF誘導的單核細胞自噬。 還原
微小核糖核酸; 單核細胞; 自噬; 巨噬細胞刺激因子;
趙仙先;
R543.5
（與０ｈ組
圖２－５ｍｉＲ－３
