FOXO1通過誘導心肌細胞自噬降低氧化自由基對其細胞損傷的分子生物學機制研究

研究背景：冠狀動脈粥樣硬化是導致心肌梗死的主要病因,心肌梗死后的靜脈溶栓和冠脈內支架植入,可以恢復梗死區域的血液供應,但是同時又會導致心肌細胞的缺血再灌注損傷。缺血再灌注導致的心肌細胞損傷主要是由于氧化自由基對其細胞代謝的影響,使心肌纖維化、心臟肥大,最終導致心肌細胞死亡,而以上病理過程最終結局為導致患者心力衰竭和患者死亡。活性氧簇(Overloaded reactive oxygen species,ROS),例如超氧陰離子、過氧化氫和羥自由基等通過氧化應激反應損傷細胞DNA、蛋白和脂肪,從而導致細胞活力降低甚至凋亡,而另一方面,包括AMP活性蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK), Sirts和活性磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶在內的機制可以對抗活性氧簇對心肌細胞的損傷,起到保護細胞功能的作用。長期一定量的Sirts表達誘導心肌細胞抗氧化和凋亡,因此人們認為對于AMP活性蛋白激酶基因敲除的小鼠,AMP活性蛋白激酶缺陷可以促進活性氧簇對于心肌細胞的損傷,綜上所述,研究抗氧化應激損傷心肌細胞的通路,對于冠心病缺血再灌注損傷治療意義重大。F0X01是轉錄因子FOX0亞家族中的主要成員之一,稱為叉頭框轉錄因子。人FOX01基因定位于13號染色體,編碼655個氨基酸。FOXO1蛋白包含4個結構域：依次為N端的forkhead區域(此區域同時也是DNA結合域)、核定位信號肽、核輸出序列和C端富含脯氨酸和絲/蘇氨酸的轉錄激活域。F0X01基因廣泛分布于成人的各組織器官中,如心臟、腦、胎盤、肺臟、肝臟、骨骼肌、腎臟、胰腺、脾臟、胸腺、前列腺、睪丸、卵巢、小腸、結腸、外周血白細胞中。FOXO1和FOXO3等Forkhead box O轉錄因子對于處于心肌細胞之外其他的各類細胞分化、代謝和衰老均具有一定的作用。有研究表明,先天性FOXO1或FOXO3缺陷的小鼠通常會發生胚胎血管異常或者繼而發生心肌肥厚,特別是近年來發現,FOXO1是維持心肌細胞正常代謝和存活的關鍵,其主要機制是FOXO1通過Hippo-YAP信號通路降低心肌細胞對抗氧化應激。除了以上外,機體還有其他多種信號通路對抗氧化應激對機體組織細胞的損傷。SIN等研究報道,SIRT1主要通過白藜蘆醇作用到FOXO1-相關心肌細胞凋亡信號通路而發揮抵抗細胞氧化自由基的作用。以往研究發現過氧化自由基會損傷細胞導致凋亡和活力下降,FOXOs是誘導細胞功能變化重要的調控因素,例如細胞分化和DNA修復,大量的研究發現,FOXOs家族對于細胞氧化自由基損傷具有重要的調控作用,FOXO1缺乏的造血干細胞對于氧化自由基損傷作用的耐受能力下降,其主要機制可能與FOXO1能活化轉錄SODs、過氧化氫酶,抗氧化酶和Prx3等抗氧化作用的酶類生成增多,同時,FoxOs會被氧化自由基、過氧化氫催化生成乙酰化或脫乙酰化FOXO蛋白而失去修復作用。磷酸化或乙酰化FOXOs是基因表達修飾的重要的方式,FOXO1活力主要是通過將FOXO1磷酸化后將其轉移到細胞質被抑制,而FOXO1的乙酰化能夠增強FOXO1的穩定性,具有保護胰腺β細胞損傷的作用或者是通過轉錄激活Bim來促凋亡。有研究發現,FOXO1磷酸化通過調節FOXO1的活性從而調節細胞生存和凋亡,然而對于心肌細胞如何通過FOXO1磷酸化調節FOXO1的活性尚不清楚。近年來有研究發現,FOXO1具有促進細胞自噬的作用,FOXO1可以通過誘導RAS-相關GTP-binding蛋白RAB7A的表達從而促進細胞自噬,因此,FOXO1是否參與到氧化自由基對心肌細胞損傷的修復中,FOXO1與氧化自由基損傷的心肌細胞的凋亡和自噬的關系如何,有待于進一步的進行研究。因此,本文通過研究FOXO1對于心肌細胞氧化應激損傷的作用,從而揭示FOXO1的功能是誘導氧化應激損傷還是保護損傷的心肌細胞,還是兩個兼有。同時進一步研究心肌細胞特異性缺失FOXO1促進氧化應激導致的心肌細胞凋亡的機制和FOXO1過表達通過促進細胞自噬降低細胞凋亡的機制,本研究對于尋找抗心肌缺血再灌注損傷的藥物治療靶點,提高心肌梗死治療療效意義重大目的：1.通過過氧化氫培養心肌細胞模擬過氧化自由基對心肌細胞損傷,檢測過氧化氫對心肌細胞凋亡的影響,檢測FOXO1在蛋白、mRNA以及磷酸化水平的變化。以探討FOXO1對于心肌細胞氧化應激損傷的作用。2.利用轉染技術使FOXO1沉默,用不同濃度FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞,檢測FOXO1 mRNA的含量、細胞凋亡比例。在200uM過氧化氫培養后,用不同濃度FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞,檢測caspase 3含量、PARP含量、caspase 3活性、自噬囊泡的形成以及及LC3II與LC3I的比值,以探討FOXO1與過氧化氫培養下心肌細胞凋亡和自噬的相關機制。方法：1細胞系處理方法：培養人類心肌細胞系H9c2,不同濃度過氧化氫培養細胞來模擬細胞受到氧化自由基損傷的模型,將培養好的H9c2細胞放置于0uM、50uM、 100uM、200uM H2O2混合氣體中培養24到48小時。2過氧化氫培養H9c2心肌細胞后檢測細胞凋亡H9c2心肌細胞用0uM和200uM過氧化氫分別培養24小時和48小時后,用Annexin V-FITC和碘化丙啶對H9c2心肌細胞進行染色,然后用流式細胞分析儀進行細胞凋亡檢測,細胞凋亡的結果用凋亡細胞比全部細胞進行表示。3.過氧化氫培養H9c2心肌細胞后檢測caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表達。0uM和200uM過氧化氫分別培養H9c2心肌細胞24小時和48小時,通過蛋白免疫印跡電泳法檢測caspase 3和PARP蛋白表達,通過熒光電泳法檢測H9c2心肌細胞的caspase 3活性的表達,4.過氧化氫培養H9c2心肌細胞后檢測FOXO1蛋白水平和FOXO1磷酸化表達OuM、50uM、100uM、200uM過氧化氫培養H9c2心肌細胞后,用蛋白免疫印跡試驗檢測FOXOI蛋白水平和FOXO1磷酸化表達。5.過氧化氫培養H9c2心肌細胞后檢測FOXO1mRNA水平表達OuM、50uM、100uM、200uM過氧化氫培養H9c2心肌細胞后,用實時反轉錄PCR檢測FOXO1mRNA水平表達。6.用FOXO1-specific siRNA轉染H9c2心肌細胞,使FOXO1沉默通過轉染方法沉默FOXOI,用濃度為25nM、50nM的FOXO1-specific siRNA轉染H9c2心肌細胞,未用FOXO1-specific siRNA只有脂質體處理的作為對照組。7.FOXO1-specific siRNA轉染H9c2心肌細胞后,檢測FOXO1mRNA水平表達用25nM、50nM FOXO1-specific siRNA轉染H9c2心肌細胞后,用實時反轉錄PCR檢測FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞和空白對照組FOXO1mRNA水平。8.FOXO1-specific siRNA轉染H9c2心肌細胞后,檢測細胞凋亡用25nM、50nMm FOXO1-specific siRNA轉染H9c2心肌細胞后,用Annexin V-FITC和碘化丙啶對H9c2心肌細胞進行染色,然后用流式細胞分析儀檢測FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞組和空白對照組的細胞凋亡。9.200uM過氧化氫培養FOXOl-specific siRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達。200uM過氧化氫分別培養25nM、50nM FOXO1-specific siRNA心肌細胞和空白對照細胞后,通過熒光電泳法檢測caspase 3活性的表達,通過蛋白免疫印跡電泳法檢測caspase 3和PARP蛋白表達。10.過氧化氫培養FOXOl-specific siRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測細胞自噬0uM和200uM過氧化氫分別培養50nM轉染FOX01-specific siRNA心肌細胞和空白對照細胞后,利用綠色熒光蛋白染色觀察自噬囊泡,利用綠色熒光蛋白檢測儀定量檢測GFP-LC3、LC3Ⅱ/LC3I。統計學處理：全部數據采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析,多組間不同組別間差異比較采用方差分析,有統計學意義后進行兩兩比較,采用LSD進行多重兩兩比較,兩組間比較采用雙尾t檢驗,顯著性水平設定為0.05,當P值小于0.05,差異具有統計學意義。結果：1.過氧化氫培養H9c2心肌細胞后檢測細胞凋亡：隨著過氧化氫培養濃度的增加、培養時間的延長,細胞凋亡增加。2.3.過氧化氫培養H9c2心肌細胞后檢測caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表達。隨著過氧化氫培養濃度的增加、培養時間的延長,caspase 3和PARP蛋白以及caspase 3活性表達增加。3.過氧化氫培養H9c2心肌細胞后檢測FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平和FOXO1磷酸化表達用OuM、50uM、100uM、200 uM過氧化氫培養H9c2心肌細胞,FOXO1蛋白水平、FOXO1mRNA水平組間差異無統計學意義。與以上規律相反,H9c2心肌細胞在用0uM、50uM、100uM、200uM濃度的過氧化氫培養下,隨著過氧化氫濃度的增高,FOXO1的磷酸化水平逐步升高,且差異均有統計學意義,磷酸化程度與過氧化氫濃度呈計量依賴性。4.FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞組和空白對照細胞組FOXO1mRNA的表達FOXO1-specific siRNA轉染細胞組FOXO1mRNA的表達低于空白對照細胞組,差異具有統計學意義(P<0.01),隨著FOXO1-specific siRNA轉染濃度的增大,FOXO1mRNA的含量逐漸減小,組間差異有統計學意義(P<0.01)。5.FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞凋亡檢測FOXO1-specific siRNA轉染細胞組細胞凋亡高于空白對照組間,差異具有統計學意義(P<0.05),隨著FOXO1-specific siRNA轉染濃度的增大,細胞凋亡升高,組間差異有統計學意義(P<0.05)。6.200uM過氧化氫培養FOXOl-specific siRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達。200uM的過氧化氫培養下的FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞的caspase3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達均高于空白對照組(P<0.05)。隨著FOXO1-specific siRNA轉染濃度增高而增高,caspase 3活性以及caspase 3和PARP蛋白表達增高,組間差異具有統計學意義(P<0.05)。7.過氧化氫培養FOXO1-specific siRNA轉染心肌細胞和空白對照細胞后,檢測細胞自噬200 uM過氧化氫可以明顯誘導對照組細胞自噬囊泡的形成(綠色熒光蛋白陰性點),200 uM過氧化氫培養下,50nM FOXO1-specific siRNA細胞組自噬囊泡低于對照組(綠色熒光蛋白陰性點),200 uM過氧化氫培養下,50nMFOXO1-specific siRNA細胞組的GFP-LC3、LC3II/LC31低于對照組(P<0.05)。即FOXO1-specific siRNA轉染H9c2心肌細胞組降低過氧化氫誘導自噬(p<0.01).結論1.過氧化氫損傷心肌細胞造模成功,并將心肌細胞FOXO1沉默(用FOXO1-specific siRNA轉染H9c2細胞)。2.隨著過氧化氫濃度的升高和培養時間的延長,心肌細胞凋亡、caspase 3、PARP蛋白水平及caspase 3活性升高,呈劑量依賴性。提示過氧化氫誘導凋亡。3.過氧化氫培養心肌細胞,FOXO1在蛋白和mRNA的水平未發生變化,隨著過氧化氫的濃度增高,FOXO1磷酸化水平升高,提示過氧化氫誘導心肌細胞凋亡可能是通過促FOXO1磷酸化,進而抑制FOXO1對心肌細胞的修復作用。4.在200uM過氧化氫培養后,隨著FOXO1-specific siRNA轉染濃度增高,細胞凋亡比例、caspase 3含量、PARP含量以及caspase 3活性增高。提示FOXO1沉默促進過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡,進而說明FOXO1抑制過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡。5.200uM過氧化氫誘導對照組細胞自噬囊泡的形成,過氧化氫培養FOXO1-specific siRNAH9c2轉染心肌細胞,自噬囊泡減少、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ降低。提示過氧化氫誘導心肌細胞自噬,FOXO1沉默降低過氧化氫誘導的心肌細胞自噬,進而說明FOXO1增強過氧化氫誘導的心肌細胞自噬。