miRNA-21在伊馬替尼敏感型胃腸間質瘤中的表達及通過B淋巴細胞瘤-2基位點作用機制研究

背景胃腸道間質瘤(gastrointestinal stromal tumors, GISTs)是較常見的胃腸道間葉細胞瘤,其發病率占整個胃腸道腫瘤的2%,最初在上個世紀60年代,病理學層定義為平滑肌腫瘤或神經源性腫瘤,直到1983年Mazur研究確定以胃腸道間質瘤命名,其命名主要是依據腫瘤的分化特征而提出。胃腸道間質瘤多見于中老年人,40歲以下病人極少見,發病中位年齡為50歲到60歲。一般60-70%多發于胃,20%到30%發生在小腸,只有10%以內發生在食管、結腸和直腸。胃腸道間質瘤在CT上主要表現為T1上腫塊實質部分呈低信號,與肌肉信號相當,在T2上呈高信號,腫瘤中央可以發現含氣的壞死腔和腫瘤鈣化的無信號區域,如果腫瘤中央內出現出血,會出現時間不同的混雜信號。胃部的胃腸道間質瘤占胃部腫瘤的2%-3%,發病部位一般位于胃體,胃竇發病率較低,形態大小不一,大者還可以超過30cm,大多數病變腫瘤瘤體可以向胃外生長,或者向腹膜腔蔓延。生長在小腸的胃腸道間質瘤占整個胃腸道間質瘤的20%,全段小腸均可發生,其中30%的病變多發生于十二指腸,空腸病變多于回腸,通常發生在小腸的胃腸道間質瘤,其腫瘤體積較大,惡性程度較高,其病變一般位于腸腔外,病變多為偏心性,有些小腸壁可見像動脈瘤樣擴張,其主要機制是腫瘤引起腸管皺縮及神經叢受損,影像學口服造影劑檢查多可以發現腸瘺管,向管腔內生長者,表現為腸梗阻；發生于肛門和直腸的胃腸道間質瘤發病率不足十分之一,一旦發生絕大部分為惡性,其中2/3以上惡性程度高,具有侵襲的可能,腫瘤組織多為向腸腔內生長,境界清晰,中心可見壞死病變和囊腔。結腸的胃腸道間質瘤的發病率最低,通常是小腸或胃部的惡性間質瘤瘤體轉移到結腸,一般結腸的間質瘤同上,損傷結腸壁,向腹腔蔓延。食管的胃腸道間質瘤占整個胃腸道間質瘤的1/4,患病年齡中位數是63歲,通常惡性程度高,食管的胃腸道間質瘤要與食管的其他病變鑒別,小型的食管腫物,多為食管平滑肌瘤,如果腫瘤體積較大,要與晚期食管癌和淋巴瘤或者縱膈腫瘤侵犯食管鑒別。胃腸道間質瘤轉移以肝臟轉移最常見,轉移灶CT掃描,可呈低密度,也可呈等密度,轉移灶的壞死病變較多,但是壞死后很少出血,如果胃腸道間質瘤出現轉移,多表現為全腹部多發性腫塊,病變一般較小,境界清楚,一般不出現腸系膜的侵潤和牽拉。胃腸道間質瘤淋巴結轉移很少見,因此如果在腫瘤組織周圍間淋巴結腫大,則胃腸道間質瘤的可能性不大,胃腸道間質瘤肺轉移很少見,因此,胃腸道間質瘤一般是沿著靜脈轉移,這個特征也是胃腸道間質瘤與平滑肌肉瘤的主要不同之處。從病理組織學上看,瘤細胞狹長,呈波浪狀,胞漿略嗜酸性,細胞界限不清,核梭形,兩端細。胃腸道間質細胞瘤最具特征的標記物是CD117,主要應用免疫組織化學的方法即可檢測,還有部分胃腸道間質細胞瘤還可以表達CD34,正常胃腸道肌層內CAJAL細胞核肥大細胞CD117陽性,而平滑肌細胞、血管平滑肌細胞核神經纖維不表達CD117。胃腸道間質瘤細胞起源于胃腸壁肌層的卡哈爾間質細胞,其主要作用是胃腸道神經叢節律起搏細胞。電鏡下,瘤細胞表面有較多樹突狀突起,胞漿內有少量細絲和神經內分泌顆粒,與CAJAL細胞相似。通常胃腸道間質細胞瘤在胃部直徑大于5.5cm,在腸部大于4cm,核分裂現象在胃部大于5/50HPE,在腸道大于1/50 HPE,腫瘤表現為壞死樣外觀,核異型性明顯,腫瘤細胞豐富,生長活躍,上皮樣細胞呈細胞巢或腺泡樣排列一般惡性化程度高,但現今尚無有效的指標能有預測胃腸道間質細胞瘤的轉移和惡化行為,有些專家推薦使用腫瘤的大小和核分裂作為轉移的危險性評估指標,但是方法尚不可靠。胃腸道間質細胞瘤長期以來一直被診斷為平滑肌肉瘤或惡性神經鞘瘤,隨著免疫組織化學、電子顯微鏡和分子生物學技術的發展,發現該腫瘤存在C-kit基因突變及蛋白表達,才有突破新進展,組織學上多有未分化或多功的梭形細胞或上皮樣細胞組成。間質瘤在性質上與其他腫瘤不甚相同,從其生物學性質上可分為良性、交界性和惡性腫瘤。胃腸道間質瘤惡性的表現主要是腫瘤具有浸潤侵蝕性,常常在基層侵潤或粘膜層侵潤,或者發現腫瘤有遠處臟器和淋巴結轉移。潛在的惡性的指標有腫瘤直徑大于5cm,核分裂相大于5/50hpf,腫瘤組織內出現壞死,腫瘤細胞有明顯的核異型性。我們通常應用以下依據來判定胃腸道間質瘤的良惡性,具備惡性指標1項或2項以上潛在惡性指標診斷為惡性胃腸道間質瘤,如果僅僅有一項潛在的惡性指標為交界性胃腸道間質瘤,如果沒有上述指標即可診斷為良性。胃腸道平滑肌瘤與間質瘤的區別主要有：胃腸道平滑肌瘤一般發病年齡較輕,瘤細胞較稀少,形態單一,A-Mat(+),CD 117(-),CD34(-),無C-KIT基因突變,而胃腸道間質瘤一般發病年齡大,瘤細胞形態多變,排列結構多樣,A-Mat(-),CD 117(+),CD34(+),有C-KIT基因突變。胃腸道間質瘤目前主要臨床治療方法,以外科治療為主,由于微創技術的發展,內鏡下ESD的剝離越來越讓到廣大患者接受。完整切除是手術療效提高的表現,在手術中無瘤操作,并在術中要防止腫瘤破潰,術后復發或不能手術的病人一般可以選擇腫瘤分子靶向藥物的治療。胃腸道間質瘤的大小其直徑可以從1-2cm大到20cm,一般呈局限性生長,多數腫瘤沒有完整的包膜,有時具有假包膜,惡性化程度高,有時伴有壞死局灶性出血和腫瘤組織破裂,有時可以穿破粘膜層導致消化道潰瘍。消化道間質瘤一般見于粘膜下層,通常占整個間質瘤的百分之六十,比例最少的是局限于肌層,僅僅占整個胃腸道間質瘤的十分之一。一般胃腸道間質瘤外形呈息肉狀,息肉常伴有潰瘍,多向胃腸道腔內生長,向漿膜層生長一般形成漿膜下腫瘤。位于腹腔內的間質細胞瘤腫塊一般體積較大,粘膜面一般有潰瘍形成,可有出血、壞死粘液和囊性變等等,切開腫瘤呈結節狀或分葉狀,切面呈紅色或灰白色,內部堅硬。手術切除是唯一可以治愈早期胃腸道間質瘤的方式,一般可以做局部切除和楔形切除,一般切除的范圍要大于腫瘤包膜外2厘米,胃腸道間質瘤高危患者手術后復發率較高,據相關報道,復發率可以到達80-91%,約85%的患者在手術后2-3年可以復發,通常復發的過程還伴有肝臟的轉移,一旦復發,其再治療的可能性就很低,據相關研究,即便再次手術切除,也很難提高患者的生存率,如果胃腸道間質瘤發現較早,包膜完整沒有轉移,其手術切除后5年生存率達到一半,如果切除時包膜不完整,向粘膜層侵襲,或者切除不徹底,其手術切除后5年生存率小于35%,不能切除者總生存時間為一年。伊馬替尼為蛋白絡氨酸激酶小分子抑制劑,而絡氨酸激酶能催化底物磷酸化,在細胞內傳遞信號,激發細胞增殖,絡氨酸激酶的活性部位均有ATP結合口袋,絡氨酸激酶的活性即是通過催化ATP轉移磷酸基團到底物的絡氨酸殘基上,也就是通常所說的激酶的磷酸化。伊馬替尼第一個適應癥是慢性粒細胞性白血病,而第二個適應癥是胃腸道間質瘤。伊馬替尼能夠選擇性的使PDGERA受體絡氨酸激酶抑制,對于胃腸道間質瘤中晚期或者手術不能治療,或存在惡性轉移危險的患者的預防性治療,對于提高患者的預后和延長生存時間具有重要的意義。伊馬替尼耐藥主要是由于胃腸道間質細胞瘤表達野生型的KIT或者是外顯子9突變,其主要機制是突變導致KIT結構的穩定,阻止了其與伊馬替尼的結合。伊馬替尼作為選擇性KITPDGFRA受體絡氨酸激酶抑制劑,主要應用于不能手術切除,或者切除后轉移的病例,或者是切除后復發的病患,或者是完整切除后預防性的治療,以防止胃腸道間質瘤的復發。通常,如果手術治療后發現以下現象則高度懷疑復發,首先是在切除部位或者是原發灶又發現新的腫瘤組織,或者是原發灶的周圍出現遠處轉移,或者是患者正在實施伊馬替尼治療的過程中發現腫瘤灶還在逐漸增大,影像學診斷發現,原發灶密度增高。如果能夠直接進行手術治療的,要盡早手術切除,如果不能進行手術治療的,要先行伊馬替尼治療后如果可能再行手術治療。有研究表明,手術聯合伊馬替尼及化療藥物聯合治療可以顯著的提高胃腸道間質細胞瘤的預后。但是在伊馬替尼治療過程中,胃腸道間質瘤的耐藥率較高,甚至高到70%,有些患者表現為治療之初就耐藥,一般發生率為20%,通常伊馬替尼在連續性用藥治療胃腸道間質瘤半年后發現腫瘤繼續生長,而且呈多病灶生長,一般患者耐藥其基因型多表現為GIST野生型KIT的外顯子9突變；繼發性耐藥現在學術界主要的觀點是突變導致KIT的穩定,KIT的穩定阻滯了KIT結構域與伊馬替尼的結合,還有其他突變的部位是外顯子12、14和17。miRNA最早是在1993年由LEE在線蟲中發現了長約22nt的非編碼單鏈小RNA-lin-4,該實驗首次發現由不編碼蛋白質的單鏈小分子RNA能夠調控生物體發育的過程,后來將該小分子RNA命名為miRNA,2000年有學者又在線蟲中發現了另外一個miRNA基因稱異時開關基因let-7,發現其主要功能是控制線蟲向成蟲生長,2002年,CALIN在臨床慢性淋巴細胞白血病患者血液中發現miRNA部分缺失或者表達下降,2005年,有研究發現miRNA與某些腫瘤的發生相關,也有發現miRNA與特定的靶基因例如MiR15/16h和let-7作用對于癌癥的發生發展發揮重要的作用,研制新的癌癥藥物基因靶點具有重要的意義和價值。miRNA分子鏈較小,一般為19-25個核苷酸分子的單鏈小RNA分子,成熟的miRNA的5’端有磷酸基團,3’端為羥基,miRNA主要在DNA的修復過程中抑制或組織正常細胞DNA修復產生致癌作用,同時抑制或阻止癌細胞DNA修復達到治療的效果。miRNA基因序列和位置高度保守,表達和結構多樣性,可以作為mRNA的調節因子,主要對細胞發育、細胞凋亡、細胞分化及細胞增殖起到調節作用,同時與應激反應、病毒感染、脂肪代謝及癌癥和心血管疾病均有相關性,人類基因組中有一半以上的已知miRNA成簇表達,其表達彼此相關。miRNA分子序列短小,其基因組中存在較多的互補序列,在不同的生物體內與靶基因結合的方式也不一樣,一般與多種蛋白結合,至今,miRBase公布miRNA的總數大約為3200余種,一般現階段miRNA的檢測主要通過基因克隆或者生物學篩選所得。miRNA對于癌癥相關的作用主要表現在,影響癌基因的表達,主要是通過let-7miRNA調節RAS蛋白的表達水平,其次,通過研究慢性淋巴細胞性白血病發現,miR-15/16靶向調節BCL2而誘導腫瘤細胞的凋亡,再次,通過C-myc在激活E2F1介導的轉錄同時,通過miR-17/20也減少E2F1的表達,最后,有研究報道可以通過miRNA表達譜用于人類腫瘤的分類,miRNA作為腫瘤的分類依據,不但能夠顯示區分正常和腫瘤,還可以進一步區分不同的腫瘤組織類型和正常組織類型。miRNA的檢測方法是對miRNA在生物細胞調控作用研究的關鍵和基礎,如何快速、準確的定量檢測miRNA是揭示細胞生長、凋亡、死亡或者異常生長的關鍵。通常的方法是Northern blotting法,全部的生物信息學分析都是需要Northern blotting法來驗證和確認。但該方法靈敏度低,檢測效率低。RT-PCR或者稱為反轉錄PCR法也可以檢測miRNA前體的表達含量,但前體的表達與成熟miRNA的表達往往水平不等,實時熒光定量PCR能夠較為精確的定量分析miRNA的表達,通常可以通過延生引物的方法,在5’端進行標記,可以定量的測量豐度較低的RNA的含量。原位雜交技術可以確定miRNA的空間結構及表達的差異。但近期的研究我們也發現,新的miRNA發現頻率越來越高,但是miRNA的功能研究相對緩慢,主要是由于miRNA作用靶點難以確認。大量的研究發現癌癥組織存在異常的miRNA, miRNA在癌癥的發生發展過程中起到特定的調節作用,尤其是在抑制某類蛋白質表達方面起到重要的作用。研究miRNA對于癌癥的治療具有重大意義。尤其是近年來發現,癌癥的發生與某些蛋白關系密切,這類蛋白能激活癌基因,因此miRNA與蛋白質的結構域相關,目前RNAi技術可以在體外培養細胞中沉默內源性基因,利用RNAi技術降低惡性癌癥細胞中癌基因成為腫瘤藥物治療的新的思路。因此,未來如果能夠進一步深入的研究miRNA在生物發育中的作用,揭示其基因表達調控機制和生命發展過程,并通過對腫瘤發生發展中作用機制的研究,為進一步認識腫瘤的起因,為腫瘤的診斷和靶向治療奠定基礎。近年來對于miRNA-21與癌癥的研究較多,大量的實時熒光PCR實驗或者免疫印跡實驗發現,miRNA-21在多種癌癥組織或細胞中陽性表達,主要包括神經膠質細胞瘤,消化系統腫瘤(胃癌,食管癌,膽管癌,肝癌、口腔癌)生殖系統癌癥(卵巢癌、宮頸癌)等等。如上所說miRNA-21的致癌機制尚不清楚,主要是由于其作用靶點難以確認,但近年來隨著利用Northern blotting法,全部的生物信息學分析技術的深入研究,現主要發現miRNA-21靶基因主要有33個的位點,其主要的位點有PTEN,主要的作用是抑制細胞遷移。增殖等,NFTB,主要發揮轉錄抑制因子作用,STAT3,調控轉錄,細胞運動等。APAF-1,調控細胞凋亡等。以上因子都是確認由miRNA-21直接的靶基因,以上因子的動態變化都受miRNA-21的直接調控。但是也有一些不是miRNA-21的直接靶基因,但也受miRNA-21的調控,例如,BCL-2和TIMP3等,他們往往通過別的介導因子從而受miRNA-21的調控。以上因子的調控雖然都與miRNA-21相關,但是許多過程也不僅僅和miRNA-21相關,是1miRNA-21協同其他miRNA共同作用調控,因此,miRNA-21的調控過程是較為復雜的網絡結構,有學者研究對酒精敏感的靶基因,發現JAG-1是miRNA-153, miRNA-335和miRNA-21共同的基因靶點,單獨敲除其中的一項,都不會影響神經細胞對酒精的敏感性。miRNA-21的表達過程通常是在細胞核內由RNA聚合酶生成轉錄前體,通過加工成發卡結構轉運到細胞質,最后剪切成熟。上個世紀八十年代末,由日本人十本等首先從非霍其金淋巴瘤細胞染色體中分離出Bcl-2基因,而該基因的存在與Bcl-2蛋白的表達相關。Bcl-2蛋白大小為26KD,其中含有BH4同源結構,該結構與抗凋亡蛋白的結構類似,BH3結構與其他促凋亡的蛋白結構類似,因此Bcl-2蛋白的作用與其兩個同源結構的比例相關,抗凋亡結構的比例高,Bcl-2蛋白就呈現抗凋亡的作用,反之亦然。Bcl-2主要存在于線粒體外膜,核膜和內質網膜上。Bcl-2蛋白家族分為兩類,一類是抗凋亡蛋白,例如Bcl-XL, Bcl-W,A1等,另一類促凋亡的蛋白有BAX,BAK等。通常Bcl-2家族分為三大類,抗凋亡的Bcl-2蛋白主要結構中包含BH1/BH2/BH3/BH4等,直接或間接抑制細胞死亡,促凋亡蛋白BAX,BAK,其結構中主要含有BH1/BH2/BH3,具有促進細胞凋亡,抑制癌細胞生成的作用。BH3-only,其主要的功能為增敏劑和誘導劑的作用,既可以促進凋亡作用,又可以促進抑制凋亡的作用。Bcl-2的抑制凋亡作用主要有五個通路,分別為維持細胞鈣的穩定狀態,阻止線粒體膜電位下降；抑制促凋亡BAX/BAK的細胞毒性作用,維持二者的穩定性,阻止其二聚體的形成。保護線粒體膜的功能抑制線粒體釋放細胞色素C、AIF等促凋亡蛋白的釋放,同時可以減少細胞氧化和氧化物的形成。而以上的分析說明,對于miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤樣本的表達情況尚未有相關報道,探索miRNA-21的表達與伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤臨床病理特征的相關性尚未有相關研究,探索研究的miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質細胞瘤的相互關系及作用機制,為進一步研究miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤中的作用基因靶點提供新的實驗證據,而胃腸道間質細胞瘤的發生、發展均較為隱匿,藥物治療效果不很理想,因此,臨床急需對于胃腸道間質細胞瘤相關發生發展機制進行深入研究,為開發靶向治療藥物,提高其治療效果,減少病患痛苦提供新的思路和方法。目的本文預通過研究miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤樣本的表達情況,探索miRNA-21的表達與伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤臨床病理特征的相關性,為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤治療新的藥物靶點提供有效的基礎實驗研究,我們又進一步研究的miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質細胞瘤的相互關系及作用機制,為進一步研究miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤中的作用基因靶點提供新的實驗證據,其研究成果可以直接應用到胃腸道間質細胞瘤藥物開發和臨床治療,無論是對于提高胃腸道間質細胞瘤的治療效果,降低其患者醫療花費和社會家庭的負擔均具有重大意義。為其相關miRNA-21與Bcl-2靶點的抗癌藥物的開發在臨床應用的進一步推廣提供科學依據。方法1.胃腸道間質瘤組織樣本獲取,胃腸道間質瘤T1細胞培養我們收集了2013年10月至2015年10月期間,在內蒙古醫科大學附屬醫院及廣州南方醫科大學南方醫院就診并診斷為胃腸道間質瘤的患者31例,整個實驗過程均經內蒙古醫科大學附屬醫院及廣州南方醫科大學南方醫院倫理委員會審核通過,全部患者在進行標本獲取前均簽署知情同意書,收集的病例標本我們統計了病患的性別、年齡、臨床表現、腫瘤位置,大小及其病理分型。于Cosmo Bio Co. Ltd (Tokyo, Japan)公司購買胃腸道間質瘤T1細胞,細胞用DMEM配方其主要組成為細胞溶液中添加10%的胎牛血清,1% v/v的青霉素和1%v/v的鏈霉素(Ameresco, Framingham, MA, USA).將細胞種植在培養瓶中,在5% CO2、370C的加濕培養箱中進行培養。將濃度為85%的胃腸道間質瘤T1細胞在加有2%小牛血清和5uM的伊馬替尼(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)的DMEM培養液中共培養,培養的細胞作為伊馬替尼藥物干擾細胞組。我們利用Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)試劑盒轉染生成含有非特異靶標miRNA和含有miRNA-21的85%胃腸道間質瘤細胞,并在DMEM培養液中共培養。2.RNA的提取與定量測量利用TRIzol試劑盒(Life Technologies, Grand Island, NY, USA)從胃腸道間質瘤細胞,正常胃組織作為照組組標本中提取總mRNA,并滴加核糖核酸酶抑制劑SUPERase·InTM(Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)lul,通過RT-qPCR對目標基因進行擴增,42℃C,5 min,接著95℃,10秒鐘逆轉錄,95℃,5秒,60 ℃,20秒,共40個循環。用Takara One Step RT-PCT kit (Takara, Tokyo, Japan)試劑盒定量分析Bcl-2 mRNA和miRNA-21的含量。胃腸道間質瘤細胞的miRNA用miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX,USA)試劑盒進行提取,利用1nirVanaTM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)試劑盒和Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR儀對miRNA-21的表達進行定量測量,Bcl-2 or miRNA-21倍數變化以β-actin orU6為內參采用△△Ct= ACt(stimulus)-ACt(solvent), ACt= Ct (target gene)-Ct(contol gene)公式進行計算,基礎表達水平利用2-(△Ct)公式進行計算3.熒光素酶印跡實驗我們用熒光素酶把載體插入三個相同的miRNA-21的靶位點Bcl-2基因3’UTR位點,利用脂質體2000將Bcl-2位點和Bcl-2mut位點轉染到濃度為85%胃腸道間質瘤細胞,同時將30和60 nM miRNA-21和對照小RNA進行轉染,轉染共培養24小時后利用雙熒光素試劑盒(Promega, Madison, WI, USA)進行檢測實驗。4.細胞增殖實驗、MTT比色法和細胞凋亡實驗胃腸道間質瘤T1細胞種植在12孔細胞培養板,每個孔有300個細胞,12小時后培養板分為兩組,第一組加入0 μM伊馬替尼,第二組加入5μM伊馬替尼,并且將60 nM非特異靶標miRNA和miRNA-21對細胞進行轉染,轉染后將細胞培養于37攝氏度5%C02箱中96個小時,(0.005%)結晶紫染色胃腸道間質瘤細胞30分鐘,記錄克隆數量。用MTT比色法主要檢測處理后的胃腸道間質瘤細胞活力,其過程簡單描述如下,將胃腸道間質瘤細胞種植于96孔培養板上,12小時后培養板分為兩組,第一組加入0μM伊馬替尼,第二組加入5 μM伊馬替尼,并且將60 nM非特異靶標miRNA和miRNA-21對細胞進行轉染,轉染后將細胞培養于37攝氏度5%C02箱中48個小時,細胞培養液換成MTT溶液在37攝氏度培養2小時,在分光光度計上在450nm的光波下測量其光密度。細胞活性主要測量胃腸道間質瘤細胞和對照組細胞活性相對比值,用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit (Abeam, Cambridge, UK)試劑盒對胃腸道間質瘤細胞進行染色,通過流式細胞儀檢測胃腸道間質瘤細胞在伊馬替尼處理miRNA轉染后細胞凋亡水平結果1.胃腸道間質瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的含量及兩者的相關性分析我們分析比較了全部31例胃腸道間質瘤病例特征(表1示),在胃腸道間質瘤細胞內,定量測量了miRNA-21和Bcl-2表達,其中miRNA-21/U6相對量為0.6729±0.07632,其含量顯著低于正常胃組織細胞的含量(1.0000±0.1085)差異具有統計學意義(p=0.0129),而Bcl-2 mRNA水平在胃腸道間質瘤組中(1.500±0.1484)顯著性高于正常胃組織細胞的含量(1.0000±0.1085)(p=0.0103),差異具有統計學意義。接著比較了miRNA-21和Bcl-2 mRNA之間的相關性,我們發現miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負相關關系,(R2=0.2450,p=0.0046),總之,在胃腸道間質瘤細胞中,miRNA-21水平下調,Bcl-2上調,兩者呈顯著性負相關。2.在胃腸道間質瘤中iRNA-21的作用位點Bcl-2的3’端非編碼區與Bcl-2上調的機制的關系為了進一步研究在胃腸道間質瘤中miRNA-21和Bcl-2 mRNA的相關性及Bcl-2上調的機制,我們通過對胃腸道間質瘤-TI細胞轉染miRNA-21 mimics,然后測量Bcl-2的表達。表2顯示,與轉染miRNA相比,轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞miRNA-21水平顯著上調(p<0.001 or p<0.0001 for 30or 60 nM),而與miRNA-21相反,Bcl-2 mRNA的水平在轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞顯著性下調,(p<0.05 or p<0.01 for the 30 or 60 nM,).同樣,我們在蛋白水平也證實了Bcl-2蛋白在轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞顯著性下調(p<0.05 or p<0.01).為了證實否是由于miRNA-21作用于Bcl-2的3’非編碼區,而使Bcl-2的下調,我們在轉染miRNA-21 mimics和轉染對照miRNA的胃腸間質瘤細胞進行比較,采用了熒光素酶活性檢測來研究Bcl-2的3’非編碼區質粒報告和單純Bcl-2的3’非編碼區報告,圖3為質粒報告和Bcl-2mut報告結構流程圖,熒光素酶報告顯示,與對照組轉染RNA的胃腸間質瘤細胞比較,轉染30和60 nMmiRNA-21 mimics的胃腸間質瘤細胞熒光素酶活性顯著降低(p<0.001 for 30 or 60nM),而Bcl-2mut報告miRNA-21 mimics并無降低熒光素酶,以上研究證實了在胃腸間質瘤細胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非編碼區,而使Bcl-2的下調。3.miRNA-21可以使胃腸道間質瘤細胞對伊馬替尼敏感我們采用克隆實驗進一步驗證胃腸道間質瘤細胞中miRNA-21是否能使細胞對伊馬替尼治療敏感,5 μM伊馬替尼顯著降低胃腸道間質瘤細胞克隆(p<0.01),同樣,與對照組轉染miR的胃腸道間質瘤細胞比較,5μM伊馬替尼顯著降低轉染60 nM miR-21 mimics胃腸道間質瘤細胞克隆(p<0.001,p<0.05).,同時,我們檢測了轉染60 nM miR-21 mimics和miR Control對照的并用伊馬替尼處理的胃腸道間質瘤細胞的活性和細胞凋亡率,轉染60 nM miR-21 mimics和miR Control對照的并用胃腸道間質瘤細胞細胞活性無差異,而轉染60nM miR-21 mimics和miR Control對照的并用5μM伊馬替尼處理24或48小時候,胃腸道間質瘤細胞細胞活性顯著性降低。(p<0.05 or p<0.01),轉染60 nMmiR-21 mimics并用伊馬替尼處理的胃腸道間質瘤細胞下降的幅度比miR對照更大(p<0.05伊馬替尼處理24小時或48小時),同時我們檢測到伊馬替尼誘導轉染60 nM miR-21 mimics胃腸道間質瘤細胞的凋亡,(p<0.05伊馬替尼處理24小時或48小時),因此,miRNA-21可使胃腸道間質瘤細胞對伊馬替尼藥物的敏感性增強。結論1、我們成功的培養了胃腸道間質瘤細胞T1的模型,為進一步研究胃腸道間質瘤細胞的特性奠定了基礎。2、miRNA-21在胃腸道間質瘤細胞內表達較正常胃粘膜細胞降低,而Bcl-2mRNA和Bcl-2蛋白在胃腸道間質瘤細胞內比正常胃粘膜細胞增高,miRNA-21和Bcl-2 mRNA呈顯著性負相關關系。3、轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞miRNA-21水平顯著上調,而Bcl-2 mRNA的水平在轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞顯著性下調,在蛋白水平也證實了Bcl-2蛋白在轉染miRNA-21 mimics后的胃腸道間質瘤-T1細胞顯著性下調。4、在胃腸間質瘤細胞中,miRNA-21作用于Bcl-2的3’非編碼區,而使Bcl-2的下調。5、伊馬替尼顯著降低胃腸道間質瘤細胞克隆。6、伊馬替尼顯著降低轉染miR-21 mimics胃腸道間質瘤細胞克隆。7、轉染miR-21 mimics和miR Control對照的并用胃腸道間質瘤細胞細胞活性無差異,而轉染miR-21 mimics和niR Control對照的并用伊馬替尼處理可以使胃腸道間質瘤細胞細胞活性顯著性降低。因此本文通過研究miRNA-21在胃腸道間質細胞瘤樣本的表達情況,探索miRNA-21的表達與伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤臨床病理特征的相關性,為尋找伊馬替尼敏感性胃腸道間質細胞瘤治療新的藥物靶點提供有效的基礎實驗研究,同時我們發現miRNA-21與Bcl-2在胃腸道間質瘤中的表現顯著性負相關,miRNA-21通過作用于Bcl-2的3’非編碼區使其下調,并且miRNA-21可提高胃腸道間質瘤細胞對伊馬替尼的敏感性。本研究其研究成果可以直接應用到胃腸道間質細胞瘤藥物開發和臨床治療,無論是對于提高胃腸道間質細胞瘤的治療效果,降低其患者醫療花費和社會家庭的負擔均具有重大意義。