幾種抗原修復法的簡單介紹

抗原修復就是利用虎穴試劑盒熱的作用將抗原重新暴露出現或修正過來的過程。

常用抗原修復法介紹：

1. 真空負壓抗原修復法：

① 切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇真空負壓處理5分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負壓干燥箱預先調至95℃，真空負壓處理10分鐘。

⑤待修復注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的年免疫組化染色方法進行染色。

這是一種操作簡單，效果特佳，溫度恒定，能一次性處理大量切片的方法。該法的最大的特點有四：一是各物質的分子在失重的情況下四處飄游，增加各分子間的碰撞機會；二是有恒定的溫度，既能使甲醛固定的蛋白發生變性，又不需要使抗原修復液達到沸騰，不會導致切片因抗原修復液的沸騰而離開載片，保證了染色的成功率，減少了因掉片而反復制片的麻煩，保證了病理報告的及時發生，為病人爭取更多的時間；三是不受條件限制，不管是金屬性的不是非金屬的都可以進行操作；四是可以一次性制作大批的切片。

2.微波輻射抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內微波輻射10分鐘，如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。

⑤待修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學的染色方法進行染色。

該法與上法相比，從實驗結果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬次的快速運動產生瞬間熱。當然，光靠微波的作用是不夠的，還必須依靠熱的作用，方能達到目的。應用微波輻射，它有雙重作用，微波輻射可以使各物質分子作極性運動。促進形成的醛鍵斷裂開。分子間運動所產生的瞬間熱，當達到有效的溫度后，就可導致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點是：產熱迅速，容易操作，也容易引起抗原修復液的沸騰，使用微波爐時禁止使用金屬性的器皿，以防引起失火或爆炸。

3.高壓抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入抗原修復液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續1－4分鐘。

⑤待修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學染色方法進行染色。

該法高壓和高熱來促進醛鍵的斷裂，當加熱至開鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時的溫度已達121℃左右。該法被應用于一些較難修復的抗原，經多次實驗認為，該法效果不錯。

4.隔水熱抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應不斷用溫度計測其溫度，待抗原修復液的溫度達到有效溫度后（92℃↑）。即開始計時，持續40分鐘。

⑤待抗原修復液恢復至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進行染色。

該法應用隔水熱方法，效果不及前面三種方法，它需要較長時間的熱的作用，在早期應用于Er和Pr染色的抗原修復時，我們的修復時間為40分鐘，如果達不到這時間，效果將不理想。

5.電爐加熱抗原修復法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 將切片放入抗原修復液中于電爐上加熱，不時用溫度計測量溫度，當達92℃后，即可拔離電源，當溫度低于92℃時，再插上電源，如此反復持續至10分鐘左右。

⑤待抗原修復液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進行染色。

對各種抗原修復方法的評價。

該法是在沒有上述的設備時才選用的一種方法，當然效果是最差的，因為它只是單靠熱的作用，這是遠遠不夠的，另外，電爐加熱必須常用溫度計來測量溫度，對其溫度不好控制，有時需要多次關閉電源來維持所需的溫度。

抗原修復的方法選擇

抗原修復關系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。不適當的抗原修復方式會導致染色弱陽性。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。不適當的抗原修復方式會導致染色弱陽性。因此應當根據不同的抗原特點，采用不同的修復方法。對某些細胞內抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細胞 間質抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。用于IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時間及溫度等均要 視組織固定的不同，所檢測抗原的性質、組織類型的不同而異，應通過預實驗摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細胞內抗原，如 Keratin，CEA，GFAP等。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細胞內抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細胞間抗原的消化，如 fibronectin，Laminin，各型膠原等。消化時間和組織固定的長短呈正比。 在 用酶消化，熱修復后均不能獲得結果的前提下使用抗原修復與酶消化結合的方法，有時會取得較為滿意的結果。一般蛋白酶K和微波相結合，但應注意，可能檢測的抗原無論何種性質均會在核內出現假陽性反應。以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩定, 高壓加熱方法效果優于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復效果無任何影響，而PH值則影響較大。 緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。

免疫組化抗原修復法的注意事項：

1、pH的應用范圍及選擇

抗原修復液的pH非常重要，有效的抗原修復pH要比修復液的化學成分更重要，同樣的修復液隨著pH的升高染色的強度逐漸增強，但最佳pH范圍為6.0-10.0。目前大家公認的最好的抗原修復液是pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液。作為通用修復液堿性pH的修復液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性pH的修復液則優于堿性的修復液。

2、抗原修復時應選擇最佳溫度

70-90℃的溫度對未經固定的蛋白質可發生變性，但經福爾馬林固定的蛋白質，溫度必須達到92℃以上方能使其變性。研究結果顯示，溫度為92-98℃是合適的，95℃效果最好。

3、抗原修復液必須遵循自然降溫規律，否則效果不好或達不到抗原修復的目的

抗原修復持續時間過后，取出放于室溫中讓其慢慢地降溫，絕對不能為了爭取時間，強行用冰塊或冷水使其降溫。這是因為當高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其他的束縛或聯結，要有一個自然環境讓其自然放松下來，隨著溫度的降低，它們會慢慢地恢復原來的形態和構型。