幾種抗原修復(fù)法的簡單介紹

抗原修復(fù)就是利用虎穴試劑盒熱的作用將抗原重新暴露出現(xiàn)或修正過來的過程。

常用抗原修復(fù)法介紹：

1. 真空負(fù)壓抗原修復(fù)法：

① 切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇真空負(fù)壓處理5分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），真空負(fù)壓干燥箱預(yù)先調(diào)至95℃，真空負(fù)壓處理10分鐘。

⑤待修復(fù)注降至室溫的一，PBS洗3次，隨后按選好的年免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

這是一種操作簡單，效果特佳，溫度恒定，能一次性處理大量切片的方法。該法的最大的特點(diǎn)有四：一是各物質(zhì)的分子在失重的情況下四處飄游，增加各分子間的碰撞機(jī)會；二是有恒定的溫度，既能使甲醛固定的蛋白發(fā)生變性，又不需要使抗原修復(fù)液達(dá)到沸騰，不會導(dǎo)致切片因抗原修復(fù)液的沸騰而離開載片，保證了染色的成功率，減少了因掉片而反復(fù)制片的麻煩，保證了病理報(bào)告的及時發(fā)生，為病人爭取更多的時間；三是不受條件限制，不管是金屬性的不是非金屬的都可以進(jìn)行操作；四是可以一次性制作大批的切片。

2.微波輻射抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0），于微波爐內(nèi)微波輻射10分鐘，如檢測Er和Pr則需要20輻射分鐘左右。

⑤待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)的染色方法進(jìn)行染色。

該法與上法相比，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，都不分上下。它是利用微波每秒以24億5千萬次的快速運(yùn)動產(chǎn)生瞬間熱。當(dāng)然，光靠微波的作用是不夠的，還必須依靠熱的作用，方能達(dá)到目的。應(yīng)用微波輻射，它有雙重作用，微波輻射可以使各物質(zhì)分子作極性運(yùn)動。促進(jìn)形成的醛鍵斷裂開。分子間運(yùn)動所產(chǎn)生的瞬間熱，當(dāng)達(dá)到有效的溫度后，就可導(dǎo)致甲醛固定后的蛋白的變性。該法的特點(diǎn)是：產(chǎn)熱迅速，容易操作，也容易引起抗原修復(fù)液的沸騰，使用微波爐時禁止使用金屬性的器皿，以防引起失火或爆炸。

3.高壓抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入抗原修復(fù)液中，邊同容器放入高壓鍋中加熱至沸騰。蓋上壓力閥至噴汽后持續(xù)1－4分鐘。

⑤待修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選好的免疫組織化學(xué)染色方法進(jìn)行染色。

該法高壓和高熱來促進(jìn)醛鍵的斷裂，當(dāng)加熱至開鍋，加上高壓閥后，汽體噴出，此時的溫度已達(dá)121℃左右。該法被應(yīng)用于一些較難修復(fù)的抗原，經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)認(rèn)為，該法效果不錯。

4.隔水熱抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④切片放入0.01M檸檬酸鹽緩沖液（PH6.0）中，邊同容器一起放入水溶鍋中加熱，其間應(yīng)不斷用溫度計(jì)測其溫度，待抗原修復(fù)液的溫度達(dá)到有效溫度后（92℃↑）。即開始計(jì)時，持續(xù)40分鐘。

⑤待抗原修復(fù)液恢復(fù)至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定好的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

該法應(yīng)用隔水熱方法，效果不及前面三種方法，它需要較長時間的熱的作用，在早期應(yīng)用于Er和Pr染色的抗原修復(fù)時，我們的修復(fù)時間為40分鐘，如果達(dá)不到這時間，效果將不理想。

5.電爐加熱抗原修復(fù)法：

①切片脫蠟至水。

②0.3%H2O2甲醇處理切片10分鐘。

③自來水洗，蒸餾水洗。

④ 將切片放入抗原修復(fù)液中于電爐上加熱，不時用溫度計(jì)測量溫度，當(dāng)達(dá)92℃后，即可拔離電源，當(dāng)溫度低于92℃時，再插上電源，如此反復(fù)持續(xù)至10分鐘左右。

⑤待抗原修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次，隨后按選定的免疫組化染色方法進(jìn)行染色。

對各種抗原修復(fù)方法的評價。

該法是在沒有上述的設(shè)備時才選用的一種方法，當(dāng)然效果是最差的，因?yàn)樗皇菃慰繜岬淖饔茫@是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，另外，電爐加熱必須常用溫度計(jì)來測量溫度，對其溫度不好控制，有時需要多次關(guān)閉電源來維持所需的溫度。

抗原修復(fù)的方法選擇

抗原修復(fù)關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對免疫組化染色效果有很大影響。不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式會導(dǎo)致染色弱陽性。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式會導(dǎo)致染色弱陽性。因此應(yīng)當(dāng)根據(jù)不同的抗原特點(diǎn)，采用不同的修復(fù)方法。對某些細(xì)胞內(nèi)抗原（如Fas、Bax、FⅧ等）和細(xì)胞 間質(zhì)抗原（如Laminin、CoIV等）則需要用酶消化法處理切片。用于IHC消化的酶很多，所選酶的種類，使用的濃度，PH值，消化時間及溫度等均要 視組織固定的不同，所檢測抗原的性質(zhì)、組織類型的不同而異，應(yīng)通過預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索確定。使用酶消化的原則：胰蛋白酶和蛋白酶K一般用于細(xì)胞內(nèi)抗原，如 Keratin，CEA，GFAP等。一般說來，胰蛋白酶消化能力較胃蛋白酶弱，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的消化，胃蛋白酶主要用于細(xì)胞間抗原的消化，如 fibronectin，Laminin，各型膠原等。消化時間和組織固定的長短呈正比。 在 用酶消化，熱修復(fù)后均不能獲得結(jié)果的前提下使用抗原修復(fù)與酶消化結(jié)合的方法，有時會取得較為滿意的結(jié)果。一般蛋白酶K和微波相結(jié)合，但應(yīng)注意，可能檢測的抗原無論何種性質(zhì)均會在核內(nèi)出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。以高壓加熱方法、微波加熱方法較為穩(wěn)定, 高壓加熱方法效果優(yōu)于微波加熱方法和單純加熱方法。溶液的濃度對修復(fù)效果無任何影響，而PH值則影響較大。 緩沖液以檸檬酸緩沖液和Tris-HCL較常用。

免疫組化抗原修復(fù)法的注意事項(xiàng)：

1、pH的應(yīng)用范圍及選擇

抗原修復(fù)液的pH非常重要，有效的抗原修復(fù)pH要比修復(fù)液的化學(xué)成分更重要，同樣的修復(fù)液隨著pH的升高染色的強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，但最佳pH范圍為6.0-10.0。目前大家公認(rèn)的最好的抗原修復(fù)液是pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液和pH8.0的EDTA緩沖液。作為通用修復(fù)液堿性pH的修復(fù)液要比酸性的有效，而對固定很長時間舊的存檔組織，酸性pH的修復(fù)液則優(yōu)于堿性的修復(fù)液。

2、抗原修復(fù)時應(yīng)選擇最佳溫度

70-90℃的溫度對未經(jīng)固定的蛋白質(zhì)可發(fā)生變性，但經(jīng)福爾馬林固定的蛋白質(zhì)，溫度必須達(dá)到92℃以上方能使其變性。研究結(jié)果顯示，溫度為92-98℃是合適的，95℃效果最好。

3、抗原修復(fù)液必須遵循自然降溫規(guī)律，否則效果不好或達(dá)不到抗原修復(fù)的目的

抗原修復(fù)持續(xù)時間過后，取出放于室溫中讓其慢慢地降溫，絕對不能為了爭取時間，強(qiáng)行用冰塊或冷水使其降溫。這是因?yàn)楫?dāng)高溫中的抗原蛋白分子鏈脫離了其他的束縛或聯(lián)結(jié)，要有一個自然環(huán)境讓其自然放松下來，隨著溫度的降低，它們會慢慢地恢復(fù)原來的形態(tài)和構(gòu)型。