我現在在做小鼠各種組織冰凍切片，但是切出來的片子總是有很多空泡形成，而且還很容易碎，不知道哪一步除了問題，下面是我的實驗步驟：

氣體麻醉機麻醉小鼠，

1.先用10ml的生理鹽水（預先加熱到37oC）；將老鼠，一般是30g，平放在冰塊上，從下開始剪切，不能剪到內臟，破胸腔，將心臟暴露，用針尖（頭皮針6號，針尖磨鈍）小心地插入左心室（尖端靠右，剪破右心室，會有血流出），剛開始要快一點。，可以看到肝變白，還有肺，

2.用50ml的注射器吸10ml的PFA（平時4oC保存，要用時放入碎冰中），一共要注射3管(近30ml)。四肢抽搐，尾巴翹起來，第一管要快一點，但是太快血管會破裂，第二管稍微慢一點，第三管比第二管慢，然后再吸入空氣，注射進老鼠體內。此時，四肢僵硬，肝硬肺白。整個灌注過程不到10min。

3．依次剪下老鼠的內臟，心肝脾肺腎和大腦，放入4%的PFA中，4oC保存24h-48h，固定。

沉糖

將內臟放入冰箱保存過夜，24h以上。再用10%，20%，30%的蔗糖溶液浸泡，每一個溶液都要從漂浮浸泡到沉底才可以換下一濃度溶液。第一個濃度大概1-2h，除了肺和心，然后20%的大概過夜，。30%的會好幾天。其實在30%的時候不要這么久沉，但是有的時候來不及切片，就一直在4度冰箱30%的濃度保存。中間會換一次30%的蔗糖溶液。用的是pbs配。

然后切片時直接從蔗糖溶液中取出，用濾紙吸干，-20度包埋膠包埋，然后組織都是切大概6um，再片子放到-20度，需要時取出來染色，一般蘇木素是20min，1%的鹽酸酒精分化2-3s，然后伊紅10s。再梯度脫水封片。結果染出來的片子不好看，考多空洞，看不到細胞結構，不知道哪一步驟除了問題.

第一幅圖，感覺你的蘇木素加的不均勻，看上去上濃下稀，出現汽泡可能是你的組織有冰晶形成；第二幅圖感覺還行；第三幅圖，細胞明顯有問題，（1）是不是你固定的不充分，固定如果不充分還不如不固定；（2）還要考慮下，組織是不是保存不當，發生自溶（像融化的樣子）。

看你的操作步驟，個人感覺是沒有問題的，組織切片時容易碎，顯得很脆，可能你切片太薄了，冰切普遍厚于石蠟的，看有的專家說，沉糖后可以避免組織太脆，我目前也做小鼠組織的冰切實驗，但組織都沒有經過固定處理，一般都是切片后直接晾干做IHC或免疫熒光.